grăsimi

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Rezultatul
  • Caracterizarea microbiomului Macaca fuscata
  • Dieta structurează în primul rând microbiomul intestinal
  • Dieta mamei structurează descendenții microbilor
  • HFD reduce descendenții Campylobacter
  • discuţie
  • metode
  • Proiectare experimentală
  • Secvențierea microbiomului
  • Analiza datelor 16S
  • PCR cantitativă
  • Mai multe detalii
  • trepte
  • Bioproiect
  • Informatii suplimentare
  • Fișiere PDF
  • Informatii suplimentare
  • Comentarii

obiecte

  • disbioză
  • Tulburări metabolice
  • microflora
  • Nutriție

abstract

Microbiomul intestinal este un ecosistem unic și un mediator esențial al metabolismului și obezității la mamifere. Cu toate acestea, studiile care examinează efectul nutriției asupra dezvoltării microbiomului intestinal la o vârstă fragedă lipsesc în special, în special în modelele de primate. Aici raportăm că o dietă maternă sau postnatală bogată în grăsimi, dar nu și obezitatea în sine, structurează microbiomul intestinal al descendenților din Macaca fuscata (macac japonez). Disbioza microbiană rezultată este corectată doar parțial după înțărcare printr-o dietă de control cu ​​conținut scăzut de grăsimi. Expunerea precoce neașteptată la o dietă bogată în grăsimi a redus cantitatea de campylobacter nepatogen în intestinul juvenil, sugerând un rol potențial pentru grăsimile dietetice în formarea comunităților microbiene comensale la primate. Datele noastre pun sub semnul întrebării conceptul de microbiom intestinal care cauzează obezitate și oferă mai degrabă dovezi ale contribuției nutriției materne la stabilirea microbiotei, care la rândul său afectează menținerea metabolismului în intestine.

Microbiomul intestinal este un ecosistem robust locuit de aproape 100 de miliarde de bacterii. Aceste bacterii comensale codifică căi enzimatice care permit metabolismul și sinteza acizilor grași și a vitaminelor 1, 2. La naștere, se crede că microbioticele vaginale și fecale de la mamă inoculează cavitatea bucală a nou-născutului, care este baza microbiotei intestinale la descendenții 3, 4. Pe măsură ce copilul crește și se introduc alimente noi, microbiomii se extind în bogăție și diversitate și ajung la o stare stabilă la scurt timp după înțărcare, reflectând microbiotii adulți 5, 6. Efectul nutriției materne gestaționale, calea de administrare și lactație asupra structurii filogenetice a microbiomului intestinal infantil și juvenil este încă insuficient investigat în modelele bine controlate 3, 4, 5, 7 .

În acest studiu, am constatat că Mucaca fuscata (macac japonez) este un model reprezentativ pentru studiul microbiomului uman. Mai mult, suntem capabili să investigăm rolul nutriției materne în timpul sarcinii și alăptării în stabilirea microbiomului juvenil. Am constatat că, în timp ce microbiomul este structurat în principal pe baza dietei, găsim modificări persistente în microbiomul juvenil pe baza nutriției materne; aceste schimbări persistente au avut loc în ciuda coexistenței cohortelor noastre juvenile. Aceste studii contribuie la extinderea muncii și oferă dovezi că dieta ne modelează foarte mult microbiomul. Aceste studii oferă în continuare o perspectivă asupra modului în care dezvoltarea microbiomului a influențat potențial dezvoltarea dietei umane pentru a promova apariția stărilor de boală metabolică.

Rezultatul

Caracterizarea microbiomului Macaca fuscata

Pentru a investiga contribuția relativă a manipulării nutriției materne și a corpului la formarea microbiogenului la primate, am efectuat studii metagenomice în modelul nostru bine caracterizat al macacului japonez (Macaca fuscata) 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32. Am determinat mai întâi relevanța comparativă a M. fuscata la oameni la mai multe locuri din corp prin colectarea de probe orale, vaginale și intestinale de la primate adulte sănătoase care nu sunt însărcinate și efectuarea 454 pirozecvenței ARNr 16S împreună cu analiza filogenetică a coordonatelor principale ). Similar oamenilor 2, 20, 33, dar unici la șoareci, am observat agregarea discretă a microbiotilor orali, vaginali și intestinali, ceea ce înseamnă că aceste situri ale corpului păstrează în mare parte nișe unice ale populației, deși taxoni împărtășiți cu unii indivizi care demonstrează scaun. vaginul (Fig. 1a).

ADN-ul a fost izolat din tampoane M. fuscata sau H. sapiens obținute din intestin (rect, colorectal și scaun), cavitatea vaginală sau orală. Secvențierea 16S rDNA a fost efectuată utilizând un sistem 454 FLXtitanium și secvențele au fost analizate utilizând software-ul QIIME. A ) Graficele PCoA care arată diversitatea beta a probelor prelevate din tampoane intestinale (albastre), vaginale (roșii) sau orale (portocalii). Numărul de animale (n) utilizate pentru fiecare loc al corpului este indicat între paranteze în legenda figurii. b ) Numărul de bacterii izolate din cavitatea intestinală, vaginală sau orală a M. fuscata (această lucrare) sau H. sapiens (utilizând HMP, disponibil la //www.hmpdacc.org/). Fiecare tulpină este reprezentată în arborele filogenetic de o culoare diferită. Numărul total de mame și pui de la care a fost derivată caracterizarea microbionului a fost de 50, cu probe provenind din mai multe părți ale corpului.

Imagine la dimensiune completă

Am comparat în continuare taxonii de la fiecare sit al corpului cu datele disponibile publicului din Proiectul Microbiomului Uman (HMP; hmpdacc.org). La nivel de filum, taxonii intestinali au fost similari și au fost dominați de bacteroidete și Firmicutes (Fig. 1b). Cu toate acestea, la nivel de gen, au existat diferențe evidente în Bacteroidetes. În special, apariția bacteriilor la om și Prevotella la macaci este cel mai probabil o reflectare a diferențelor alimentare. Bacteroizii codifică enzime pentru digerarea grăsimilor saturate și a proteinelor animale care sunt mai frecvente în dieta occidentală 5, în timp ce reconstrucțiile metabolice din Prevotelle sunt dominate de căi pentru digestia plantelor xilan și celulozei, care sunt mai frecvente în dieta omnivoră a M. fuscata și populații agrare.populația Burkina Faso 5. Microbiota orală a fost similară aproximativ la nivelul tulpinii, cu excepția abundenței relative mai mari de Fusobacteria la om (Fig. 1b). În general, comunitățile microbiene intestinale și orale ale M fuscata sunt similare cu cele de la oameni.

Microbul vaginal M. fuscata conținea mai puțin Lactobacillus decât la om, era considerabil mai divers decât omul și conținea taxoni asociați cel mai frecvent cu microbiomul intestinal. În timp ce diversitatea bacteriană crescută în microbiomul vaginal uman este asociată cu vaginoza bacteriană 34, 35, alte primate (de exemplu, babuini) poartă diversitate microbiană vaginală similară cu ceea ce am observat la macacii sănătoși și însărcinați 36. Ponderea unor specimene vaginale și intestinale (Fig. 1a) sugerează că aceste profiluri de abundență maconomică la macaci se datorează cel mai probabil diferențelor anatomice și igienice care duc la contaminarea fecală.

Dieta structurează în primul rând microbiomul intestinal

Indiferent de obezitate și rezistență la insulină, grupurile HFDS (obezi, rezistente la insulină) și HFDR (sărace, sensibile la insulină) s-au grupat și s-au diferit de compartimentele CTD prin PCoA (P = 0,001 conform analizei variației de variație a permutației (PERMANOVA)). 2a) . ). Această constatare a fost confirmată de gradul de diversitate alfa și de bogăția speciilor, care nu au reușit să detecteze o diferență semnificativă între barajele HFDS și HFDR (Figura suplimentară 1b, c). Interesant, nu există diferențe aparente în nivelurile plasmatice circulante ale citokinelor inflamatorii 37 care ar explica diferitele agregări bazate pe dietă. Cu toate acestea, au fost raportate creșteri ale acizilor grași totali (saturați, monosaturați, polinesaturați și esențiali) și acizilor grași n-6 pentru barajele care consumă HFD 38, ceea ce este o explicație probabilă pentru motivul pentru care nu se găsesc obiceiuri și rezistență la insulină în microbiomii intestinali. .

Probele intestinale au fost prelevate de la M. fuscata menținute pe o dietă izocaretică conținând fie 13% grăsimi (dietă martor), fie 36% grăsimi (dietă bogată în grăsimi). ADN-ul a fost izolat din conținutul intestinal și s-a efectuat pirosecvențiat prin 16S rADN (454 FLXtitan). Secvențele au fost analizate folosind software-ul QIIME. A ) Grafic PCoA care demonstrează gruparea diferită a indivizilor cu o dietă de control (CTD, verde), o dietă săracă (HFDR, albastru închis) sau o dietă bogată în grăsimi (HFDS, albastru deschis). Persoanele se grupează semnificativ pe baza dietei (P = 0,001 conform PERMANOV). Numărul de animale din fiecare categorie (n) este dat între paranteze ale legendei. b ) Grafic care demonstrează diferențele în abundența tulpinilor între subiecții pe o dietă de control (CTD), o dietă săracă pe o dietă săracă (HFDR) și obezitate cu un conținut ridicat de grăsimi (HFDS). Explicațiile din dreapta graficului arată culoarea pentru fiecare bacterie reprezentată.

Imagine la dimensiune completă

Probele intestinale au fost prelevate de la M. fuscata menținute pe o dietă izocaretică conținând fie 13% grăsimi (dietă martor), fie 36% grăsimi (dietă bogată în grăsimi). ADN-ul a fost izolat din conținutul intestinal și s-a efectuat pirosecvențiat prin 16S rADN (454 FLXtitan). Secvențele au fost analizate folosind software-ul QIIME. A ) Cladogramă obținută din analiza secvențelor LEfSe 16S. Zonele verzi umbrite indică bacterii cu o incidență mai mare la animalele hrănite cu o dietă de control (CTD), în timp ce zonele umbrite albastre indică bacteriile cu o incidență mai mare la animalele hrănite cu o dietă bogată în grăsimi (HFD). b ) Numărul relativ de genuri bacteriene la animalele hrănite cu o dietă de control (CTD, bare verzi) sau o dietă bogată în grăsimi (HFD, bare albastre). Graficele casetei arată distribuția datelor cu o linie în centrul câmpului care reprezintă media. Partea stângă a medianei indică a treia quartilă și partea dreaptă a primului quartil. Liniile din dreapta casetei indică 1,5 în intervalul intercuartil al quartilei inferioare și liniile din stânga indică 1,5 în intervalul intercuartil al quartilei superioare. Punctele reprezintă valori aberante.

Imagine la dimensiune completă

Dieta mamei structurează descendenții microbilor

Vârsta de 6 luni sau până la 1 an, care este echivalentul aproximativ de dezvoltare la om pentru apariția microbiotei adulte 3, 46 .

Imagine la dimensiune completă

Având în vedere persistența efectului expunerii materne la HFD asupra taxonilor intestinali rezultați ai descendenților, am căutat să determinăm ce membri ai genului și căile metabolice taxonomice sau modelele de transmitere au condus la aceste descoperiri. Selecția funcției Borutus din datele metagenomice derivate din 16S a relevat epuizarea indusă de HFD a proteinelor bacteriene, în special a Epsilonproteobacteriei Campylobacter spp. și Helicobacter spp, împreună cu îmbogățirea Firmicutes Ruminococcus și Dialister (Fig. 5a). Când am examinat în continuare datele metagenomice derivate din 16S la nivelul genului, am constatat că Campylobacter spp a scăzut la descendenți după orice expunere la HFD, fie în timpul sarcinii/alăptării, fie după înțărcare (figurile 5b și 6). La fel ca în cohorta noastră maternă CTD (Figurile 2b și 3b), adolescenții menținuți pe CTD înțărcat au purtat Treponema în mod similar crescut (Figurile 5 și 6). Analiza taxonilor intestinali colonici ai descendenților a arătat niveluri reduse de bogăție a speciilor (Figura Adițională 2b) și diversitate (Figura Adițională 2c) cu orice niveluri de expunere la grăsimi dietetice bogate; această observație a fost confirmată de LEfSe (figura suplimentară 2d).

Harta de căldură care indică modificări la nivelul genului între M. fuscata care a consumat fie un control, fie o dietă bogată în grăsimi în timpul sarcinii/alăptării și/sau înțărcării. Cantitatea relativă a fiecărui gen este indicată de un gradient de culoare de la gri (abundență mică) la roșu (abundență mare). Harta de căldură creată folosind distanța Manhattan și gruparea ierarhică se bazează pe o interconectare medie. Legenda de deasupra hărții fierbinți indică dieta și nutriția mamei după înțărcare a fiecărui juvenil reprezentat. Pe baza dendrogramei, se observă un grup de probe de la puilor care consumă dieta martor/martor datorită numărului mai mare de Campylobacter. Numărul de tineri (n) din fiecare cohortă este dat între paranteze în legenda figurii.

Imagine la dimensiune completă

Observațiile noastre contestă în mod colectiv noțiunea că există un microbiom inerent „obezogen” și susțin mai degrabă datele emergente de la șoareci și oameni care sugerează o interacțiune transferabilă și modificabilă între dietă și comunitatea microbiană care afectează biologia gazdei (adipozitate) 9, 24. Datele noastre, care demonstrează rolul nutriției materne, nu al obezității materne în sine, în formarea microbiomului intestinal al descendenților la vârsta de 1 an, sunt în concordanță cu constatările noastre anterioare privind efectul său asupra epigenomului fetal 27, 28, 30 . Deși am văzut anterior că, după înțărcare, inversarea alimentară poate salva expresia genelor implicate în calea circadiană 27, 28, inversarea după înțărcare nu reglementează toate modificările din uterul epigenomului fetal 30. Aici descriem o altă schimbare persistentă a descendenților din cauza nutriției materne, genul Campylobacter scăzând din cauza nutriției materne. În plus față de implicațiile pentru rolul microbiotei în schimbarea epigeneticii sau invers, aceste modificări persistente în microbiom pot sprijini modificările comportamentului de anxietate care au fost deja descrise 32. În general, aceste date relevă căile potențiale implicate în diafragma dintre sistemele biologice.

metode

Proiectare experimentală

Secvențierea microbiomului

Probele au fost prelevate din tractul gastro-intestinal (scaun, colon ascendent, rect), cavitatea vaginală sau orală, iar ADN-ul a fost izolat folosind un kit de izolare a ADN Powersoil (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA). Probele intestinale au fost prelevate din ultimul scaun, conținutul părții luminale a colonului ascendent și prin introducerea unui tampon de bumbac în rect după necropsie. Probele orale și vaginale au fost prelevate prin ruperea corpului. După extracția ADN-ului, 16S rADN al bacteriei a fost amplificat și s-au folosit coduri de bare cu grunduri V3V5 pentru a identifica probele înainte de secvențierea 454; secvențele rezultate au fost analizate prin informații cantitative asupra software-ului de ecologie microbiană (QIIME) 56. Secvența primerului V3V5 cu coduri de bare minuscule este următoarea: 5'-cctatcccctgtgtgccttggcagtctcaGCCTACGGGAGGCAGCAG-3 '(primer B-354F înainte) și 5'-ccatctcatccctgcgtgtctccgactCTTNN-92N.

Analiza datelor 16S

Pretratarea a inclus îndepărtarea citirii fără cod de bare sau secvențierea primerului și apoi îndepărtarea citirii cu mai puțin de 200 nucleotide în lungime și citirea cu o calitate medie minimă mai mică de 20. AmpliconNoise 57 a fost utilizat pentru a corecta erorile introduse în PCR și piroconvenție, precum și eliminați secvențele himerice. În primul rând, distanța de curgere a fost calculată și grupată ierarhic cu o conexiune completă. Apoi, a fost folosit un algoritm de maximizare a așteptărilor pentru a elimina zgomotul de pirocvență, iar citirile au fost scurtate în continuare la 400 de perechi de baze. Eroarea PCR a fost calculată între secvențe și grupată pentru a furniza intrare către SeqNoise. Erorile PCR au fost apoi eliminate prin pasul SeqNoise. Amorsele și codurile de bare au fost excizate din secvențe dezumizate. În cele din urmă, secvențele dezumite au fost grupate în continuare prin gruparea completă a legăturilor în unități taxonomice operative (OTU) la un nivel de similaritate de 97% de către AmpliconNoise. OTU a apărut în 58. Atribuirea taxonomică a fiecărei secvențe a fost trunchiată la cel mai specific nivel taxonomic cu un scor de încredere de cel puțin 85%.

PCR cantitativă

În plus, ADN-ul izolat din M. fusata a fost, de asemenea, supus amplificării PCR pentru genul Campylobacter și ADNr 16S universal, așa cum s-a descris anterior 47, 65. Primerii utilizați pentru PCR specifică pentru Campylobacter au fost C412F 5'-GGATGACACTTTTCGGAGC -3 'și C1288R 5'-GGATGACACTTTTCGGAGC-3'. Acești primeri au generat un produs de 812 bp utilizând 28 de cicluri de amplificare PCR la 94 ° C timp de 1 minut, 55 ° C timp de 1 minut și 72 ° C timp de 1 minut. ADNr 16S universal a fost amplificat folosind primerii descriși mai sus (16SuniversalFor și 16SuniversalRev) și a generat un produs de 462 bp după 30 de cicluri de amplificare la 95 ° C timp de 1 minut, 60 ° C timp de 1 minut și 72 ° C timp de 1 minut. Produsele PCR au fost rulate pe un gel de agaroză 3% care conține bromură de etidiu. Gelul a fost vizualizat și cuantificat utilizând software-ul de analiză VisionWorks LS (Upland, CA) 66 .

Mai multe detalii

Coduri de acces: Datele metaagenomice au fost stocate în baza de date BioProject sub codul de aderare PRJNA231152.

Cum se citează acest articol: Ma, J. și colab. Dieta mamă bogată în grăsimi în timpul sarcinii schimbă în mod constant microbiomii descendenților în modelul primatelor. Nat. Comun. 5: 3889 doi: 10, 1038/ncomms4889 (2014).