obiecte
abstract
Adenocarcinomul ductal pancreatic (PDAC) este a patra cauză principală de deces prin cancer în Statele Unite, reprezentând aproximativ 40.000 de decese pe an. Prognosticul neutru al PDAC se datorează în mare măsură diagnosticului tardiv. În prezent, diagnosticul cel mai sensibil al PDAC necesită proceduri invazive, cum ar fi ultrasonografia endoscopică, care are propriile riscuri și precizie, care depinde în mare măsură de operator. Aici, am folosit caracteristicile generale ale tumorilor solide, un microambient acid generat ca un produs secundar al metabolismului, pentru a dezvolta o nouă abordare a utilizării peptidelor încorporate cu pH (scăzut) (pHLIP) pentru imagistica PDAC. Am arătat că pHLIP marcat fluorescent poate localiza și detecta în mod specific PDAC la xenogrefele umane, precum și leziunile PDAC și PanIN la modelele de șoarece modificate genetic. Această nouă abordare poate îmbunătăți detectarea, diagnosticul diferențial și etapizarea PDAC-urilor.
Aproximativ 45.000 de americani sunt diagnosticați cu adenocarcinom ductal pancreatic (PDAC) în fiecare an, iar incidența PDAC crește 1. Cu toate acestea, s-au făcut puține progrese în ceea ce privește rezultatele pacienților cu PDAC încă din anii 1970. Pilonul principal al terapiei este rezecția chirurgicală; cu toate acestea, doar 20% dintre pacienți sunt eligibili pentru rezecție din cauza prezenței unei boli avansate în momentul diagnosticului 2. Lipsa simptomelor specifice (datorită localizării fizice a organului) și lipsa biomarkerilor sensibili și specifici îngreunează obținerea unui diagnostic într-un stadiu incipient 3. Din aceste motive, este urgentă nevoie de instrumente care să ajute la depistarea precoce și specifică a PDAC înainte de dezvoltarea bolii micro-metastatice. Cele mai frecvent utilizate metode de diagnostic PDAC până în prezent, inclusiv tomografia computerizată (CT), imagistica prin rezonanță magnetică (RMN) și ultrasonografia endoscopică (EUS), nu sunt capabile să detecteze leziunile precoce și sunt utilizate în principal în stadiul de boală 3, 4 .
În studiul de față, în loc să folosim o strategie tradițională de direcționare moleculară bazată pe imagistica unei singure proteine biomarkere supraexprimate într-un subset de celule canceroase, am evaluat o abordare mai generală a direcționării: aciditatea microambientului tumoral. Acidoza se formează ca un produs secundar al metabolismului celulelor canceroase și se corelează cu dezvoltarea și progresia tumorii 5, 6, 7. Imaginarea micromediului acid evită problema comună a eterogenității biomarkerilor proteici, care limitează utilitatea agenților care vizează markeri specifici de suprafață celulară 8, 9. Am folosit sonde sensibile la pH dezvoltate recent, peptide de inserție pH (scăzute) (pHLIPs®) pentru a imagina PDAC la șoareci. PHLIP-urile sunt peptide de membrană solubile în apă, care se introduc în stratul lipidic al membranelor și formează o helică transmembranară numai în microambientul extracelular acid, ca în tumorile 10, 11, 12, 13. Am arătat că sondele pHLIP marcate fluorescent au detectat tumori PDAC, metastaze și leziuni PanIN în modele preclinice de șoarece de PDAC. Datele obținute oferă dovezi critice ale principiului care susține dezvoltarea în continuare a acestei noi abordări, care va duce în cele din urmă la o descoperire clinică pentru detectarea și diagnosticarea precoce a PDAC.
Rezultatul
Scopul studiului nostru este de a demonstra fezabilitatea acidității extracelulare pentru imagistica PDAC în diferite modele tumorale. Pentru a atinge acest obiectiv, am folosit o peptidă WT-pHLIP sensibilă la pH și controlul acesteia, 2K-WT-pHLIP (Tabelul 1), care au fost bine validate în alte modele tumorale 13, 14, 15, 16, 17. Reziduurile protonatabile Asp din porțiunea transmembranară (TM) a 2K-WT-pHLIP sunt înlocuite cu reziduuri Lys nepronatabile încărcate pozitiv, ceea ce reduce capacitatea dependentă de pH a 2K-WT-pHLIP de a intra în membrană. În plus, am investigat direcționarea PDAC-urilor cu variantele pHLIP, Var3 și Var7 (a se vedea tabelul 1), deoarece acestea au fost identificate recent ca noi variante care sunt foarte potrivite pentru imagistica tumorilor acide 12. Toate peptidele conțin un reziduu Cys pentru neintegrare în capetele membranei (Tabelul 1), care a fost conjugat cu coloranții fluorescenți Alexa546 sau Alexa647. Construcțiile au fost purificate și utilizate în studii de fluorescență in vivo și ex vivo.
Tabel în dimensiune completă
pHLIP vizează PDAC și metastaze peritoneale în xenogrefele de carcinom pancreatic uman
Imagini reprezentative in vivo bioluminescente (A) și fluorescente (B) ale șoarecilor goi atimici fără tumoră (normală, n = 5; stânga) și cu tumoră (model PDAC ortotopic cu celule Capan-2 marcate cu luciferază; n = 5) injectate cu 40 μM Alexa647 -WT-pHLIP în 100 μl PBS. Tumora și rinichii sunt marcate cu săgeți negre și albastre. Imagini reprezentative ex vivo ale pancreasului normal și PDAC de la șoareci injectați cu Alexa647-WT-pHLIP (C). Cuantificarea ex vivo a semnalului de bioluminiscență și fluorescență al pancreasului (n = 5 per grup) (D) și cuantificarea semnalului de fluorescență al ficatului, rinichilor și plămânilor (E - G). Valorile sunt medii ± SEM, * p = 0,0167, ** p = 0,0025.
Imagine la dimensiune completă
Examinarea ex-vivo a pancreasului la șoareci fără tumori și fără tumori arată că sonda WT-pHLIP vizează în mod specific pancreasul purtător de tumori, dar nu și pancreasul normal (Figura 1C, D). Semnalul de fluorescență în pancreasul șoarecilor purtători de tumori a fost de 13,6 ori mai mare (p = 0,0025) decât fluorescența din pancreasul normal (Tabelul suplimentar 1). Semnalele hepatice, renale și pulmonare au fost, de asemenea, cuantificate (Figura 1E-G și Tabelul suplimentar 1). Interesant este că semnalul în rinichi la 24 de ore după administrarea WT-pHLIP a fost semnificativ mai mare la șoarecii purtători de tumori decât la șoarecii fără tumori (Figura 1E). În plus, pentru a determina dacă acidoza poate fi utilizată ca marker pentru a detecta metastazele, șoarecii cu metastaze detectabile printr-un semnal luminescent (Figura 2A) au fost injectați cu WT-pHLIP marcat fluorescent. După 24 de ore de injectare a sondei, fluorescența WT-pHLIP din tumoarea primară și toate metastazele peritoneale a fost localizată împreună cu semnalul luminiscent (Figura 2).
Modelul PDAC ortotopic cu celule Capan-2 marcate cu luciferază injectate cu 40 μM Alexa647-WT-pHLIP în 100 μl PBS (+ pHLIP; n = 5) Semnal bioluminiscent care indică creșterea tumorii și metastaza (A) co-localizează cu un semnal fluorescent care demonstrează Direcționare dependentă de pH cu Alexa647-WT-pHLIP (B). Suprapunerea semnalului este afișată pe (C).
Imagine la dimensiune completă
pHLIP-urile acționează într-o manieră dependentă de pH pentru a detecta PDAC și metastaze la modelele modificate genetic de șoarece (GEMM) și leziunile timpurii ale PanIN
GEMM cu pancreas normal (șoareci fără tumori, n = 10) sau PDAC (șoareci purtători de tumori, n = 10) au fost injectați prin vena cozii cu 40 μM Alexa546-WT-pHLIP în 100 μl PBS (n = 5). ) sau 40 μM Alexa546-2K-WT-pHLIP (secvența peptidică modificată pentru a fi mai puțin sensibilă la pH) în 100 μl PBS (n = 5). (A) Imagini reprezentative de fluorescență ex vivo ale pancreasului, rinichilor, ficatului și plămânilor șoarecilor fără tumori (stânga) și șoarecilor purtători de tumori (dreapta) la 24 de ore după injecția Alexa546-WT-pHLIP. S-au observat metastaze hepatice (pătrate) la unii șoareci, care s-au corelat cu o creștere a semnalului de fluorescență. (B - E) Cuantificarea fluorescenței ex vivo a șoarecilor fără tumori (n = 10) și a șoarecilor purtători de tumori (n = 10) injectați cu Alexa546-WT-pHLIP sau Alexa546-2K-WT-pHLIP. (F) Comparația țintei tumorale utilizând Alexa546-WT-pHLIP și Alexa546-2K-WT-pHLIP (control). Valorile sunt medii ± SEM, * p = 0,0159, ** p = 0,0043.
Imagine la dimensiune completă
(A) H&E, fluorescența semnalului Alexa647 (WT-pHLIP) și DAPI (nuclei) de șoareci fără tumori (sus) și șoareci purtători de tumori (jos) tratați cu 40 μM Alexa647-WT-pHLIP în 100 μl PBS (n = 5). (B) Cuantificarea semnalului de fluorescență în ceea ce privește colorarea nucleară. Valorile sunt medii ± SEM, **** p
Imagini reprezentative de fluorescență ex vivo ale pancreasului (A) și cuantificarea fluorescenței pancreasului (B), rinichi (C), ficat (D) și plămân (E) de la șoareci fără tumori (n = 10), tumori șoareci purtători (n = 10), șoareci care conțin leziuni Panin (n = 5) și șoareci cu pancreatită (n = 5) injectați cu 40 μM Alexa647-WT-pHLIP în 100 μl PBS sau 100 μl PBS. Valorile sunt medii ± SEM, * p
Pe scurt, această lucrare oferă dovezi preclinice de bază folosind diferite modele de șoareci care vizează aciditatea tumorii în pancreas folosind sonde pHLIP sensibile la pH pot fi utile pentru detectarea clinică a PDAC. Acesta deschide oportunitatea de a dezvolta noi protocoale clinice de imagistică pentru a îmbunătăți detectarea, a restrânge diagnosticul diferențial și a îmbunătăți stadializarea PDAC. Alte utilizări ale acestei sonde pentru monitorizarea PDAC vor contribui la îmbunătățirea supraviețuirii, deoarece vor putea detecta majoritatea tumorilor în stadiul rezecabil.
metode
Conjugarea variantelor pHLIP cu coloranți fluorescenți
Variantele PHLIP au fost preparate prin sinteza peptidelor în fază solidă utilizând chimia Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonil) și purificate prin cromatografie în fază inversă la Laboratorul de resurse de biotehnologie WM Keck Foundation din Yale. Fiecare variantă pHLIP a fost conjugată cu AlexaFluor®546 și AlexaFluor®647 C5-maleimidă în DMSO într-un raport de 1: 1, 2 coloranți: peptidă și incubată la temperatura camerei timp de 4-8 ore. Progresul reacției a fost monitorizat prin HPLC cu fază inversă. Produsele au fost izolate prin HPLC. Identitatea maximă a fost confirmată prin spectrometria de masă SELDI-TOF și HPLC analitică. Concentrațiile peptidelor conjugate au fost determinate prin absorbanță (pentru Alexa546: ε = 93.000 M-1 cm-1 și pentru Alexa647: e = 265.000 M-1 cm-1).
Linii telefonice
Linia celulară stabilită de carcinom pancreatic (Capan-2) a fost obținută din colecția American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Celulele au fost cultivate în mod obișnuit în mediile recomandate. Toate celulele au fost menținute la 37 ° C într-o atmosferă umidificată cu 5% CO2.
imunocitochimie
Diapozitivele de țesut înghețate au fost acoperite folosind suportul de montare VECTASHIELD (laboratoare Vector, Burlingame, CA). Secțiunile au fost examinate cu un microscop Zeiss Axioplan2 și imaginile au fost capturate cu o cameră Hamamatsu ORCA-ER cu software Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Rockville, MD) și analizate folosind software-ul PCI simplu (Hamamatsu Corporation, Sewickley, PA).
Modele animale
Pentru a evalua dacă pHLIP poate servi ca biomarker pentru imagistica in vivo, s-au efectuat studii asupra xenogrefelor de carcinom pancreatic uman de imunodeficiență (obținute de la Institutul Național al Cancerului cu vârste cuprinse între 5 și 6 săptămâni) și șoareci transgenici. Animalele au fost adăpostite în MD Anderson Cancer Center. Toate procedurile la animale au fost efectuate în conformitate cu orientările instituționale ale MD Anderson Cancer Center (Houston, TX) folosind protocolul veterinar aprobat al Comitetelor instituționale pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de la Universitatea MD din Texas Anderson Cancer Center. Șoarecii utilizați pentru studii de imagistică optică au fost hrăniți cu o dietă fără clorofilă.
Modelele genetice PanIN și PDAC au fost dezvoltate prin încrucișarea șoarecilor LSL-KRas G12D 32 cu șoareci floxifiați 33 și șoareci cre pancreatici specifici (Pdx-1-Cre) 34 pentru a produce șoareci care aveau o deleție condiționată de p53 și niveluri endogene de KRas mutante G12D18., PDAC la acești șoareci s-a dezvoltat la 6-8 săptămâni după naștere 35. Frații fără PDAC au servit drept controale. În plus, șoarecii LSL-KRas G12D 32 au fost încrucișați cu tamoxifen (Ela) reglementat de CreERT (Ela-CreERT) reglementat de elastază (Ela) așa cum este descris mai sus 36 și au hrănit o dietă bogată în grăsimi timp de 30 de zile pentru a induce leziunile PanIN 1 așa cum a fost descris peste 19. Șoarecii genei LSL-KRas G12D, p53 și Pdx-1-Cre au fost obținuți de la Modele de șoareci pentru depozitul consorțiului de cancer uman (Rockville, MD).
Imagistica in vivo și ex vivo
analize statistice
Datele sunt prezentate ca medie ± SEM. Pentru studii in vivo, am folosit 5 animale pe grup (n = 5). Diferențele semnificative din punct de vedere statistic au fost determinate de un test t Student cu două cozi nepereche (P