abstract
SCOPUL: În studiul de față, am abordat întrebarea dacă există expresie specifică depozitului a inhibitorului celular al apoptozei proteine-2 (cIAP2) în copilărie și dacă expresia relativă se modifică odată cu vârsta în paralel cu riscul crescut de adipozitate viscerală.
Subiecte: S-au obținut probe pereche de țesut adipos omental uman (OM) și subcutanat (SC) de la 23 de pacienți (12 copii și 11 adulți).
METODĂ: Nivelul MRNA al cIAP2 a fost determinat utilizând reacția în lanț a polimerazei cu transcripție inversă (RT-PCR) și expresia proteinelor confirmată prin Western blot. Indicii de apoptoză au fost determinați prin marcarea terminală mediată de deoxinucleotidil transferază a dUTP-fluoresceină nichel-capăt (TUNEL).
REZULTATELE: ARNm cIAP2 a fost de 1,5 ori mai mare în OM comparativ cu țesutul adipos SC (OM> SC la 20 din 23 subiecți; P SC la nouă din 10 subiecți, P 1
Obezitatea se caracterizează printr-o creștere a greutății țesutului adipos. Greutatea grăsimii corporale, în special acumularea de grăsime viscerală, este strâns asociată cu rezistența la insulină, bolile cardiovasculare, hipertensiunea și alte tulburări metabolice majore. 2 Acest lucru a subliniat importanța identificării factorilor genetici care reglementează nu numai grăsimea, ci și distribuția grăsimilor.
Se știe că adipocitele omentale (OM) și subcutanate (SC) diferă prin diferite proprietăți metabolice care reglează volumul celulelor grase. Replicarea, diferențierea și răspunsul apoptotic al celulelor adipoase umane par a fi influențate de regiunea anatomică. 5, 6. Prin urmare, distribuția țesutului adipos ar putea rezulta dintr-o diferență specifică locului în reglarea acestor procese. Recent s-a demonstrat că caracteristicile regionale pot fi legate de diferențele specifice site-ului în expresia genelor care codifică proteine funcționale importante. De exemplu, expresia leptinei și a PPAR γ este mai mare în SC decât țesutul adipos OM. În schimb, expresia receptorului de insulină (Ex 11 -) este mai mare în OM comparativ cu țesutul adipos SC. 9
Inhibitorul celular al proteinei apoptoza-2 (cIAP2) este un membru al familiei de inhibitori ai proteinelor apoptozei (IAP), care este implicat în reglarea apoptozei în timpul proliferării și diferențierii celulare. Rolul IAP în țesutul adipos uman nu este clar, dar un număr tot mai mare de dovezi sugerează că acesta poate juca un rol în reglarea distribuției grăsimii corporale prin modularea apoptozei celulelor adipoase. Un raport a arătat că expresia dependentă de diferențiere a proteinei inhibitoare a apoptozei neuronale (NAIP) în celulele adipoase 3T3-L1 se poate corela cu dezvoltarea rezistenței adipocitelor la apoptoză. Alte două studii raportează că mARN-ul cIAP2 este exprimat într-un mod specific depozitului în adipocitele umane adulte. 14, 15
Cercetările privind diferența în expresia genelor s-au concentrat până acum pe adulți. Se știe foarte puțin despre expresia genelor la locul apariției în țesutul adipos la copii. Deoarece există diferențe legate de vârstă în țesutul adipos uman în ceea ce privește greutatea și distribuția, ne-am adresat întrebării dacă există o expresie specifică a depozitului de cIAP2 în copilărie și, dacă da, dacă expresia relativă se schimbă odată cu vârsta în paralel cu creșterea doza. riscul de adipozitate viscerală. În acest studiu, am comparat, prin urmare, nivelurile de expresie ale cIAP2 atât la nivelul ARNm cât și la nivelul proteinelor din țesutul adipos OM și SC la copii și adulți. În plus, am examinat relația dintre nivelurile de expresie cIAP2 și rata apoptozei adipocitelor, indicele de masă corporală (IMC) și sexul.
metode
Subiecte și eșantionare
Prepararea ARN și RT-PCR
Nivelurile de ARNm CIAP2 au fost determinate la toți subiecții de la care a fost disponibil ARN total atât din țesutul adipos SC, cât și din OM. ARN-ul total a fost preparat utilizând reactivul TRIzol (Invitrogen life technologies, CA, SUA) conform protocolului producătorului. ARN a fost cuantificat spectrofotometric. Integritatea ARN a fost verificată prin colorarea benzilor de ARN ribozomale cu bromură de etidiu folosind un gel de agaroză 1%. ARN-ul obținut a fost depozitat la -70 ° C până la utilizare.
RT-PCR a fost efectuat pentru analiza ARNm cIAP2. ARN total (0,5 ± 1 μg) a fost transcris invers timp de 1 oră la 42 ° C în 20 μl de tampon conținând 200 U MMLV revers transcriptază, 0,5 μg Oligo d (T) 16, 0,5 mmol/l dNTP Complementary DNA DNA (cDNA) au fost denaturate timp de 5 minute la 95 ° C și 5 μl de ADNc din fiecare probă au fost utilizate pentru amplificarea ulterioară a PCR într-un volum final de 50 μl de tampon conținând 2,5 U de ADN polimerază Taq.2 mmol/l. dNTPs, 2,5 mmol/l MgCl2 și 0,4 μmol/l fiecare primer. Condițiile PCR au fost de 95 ° C timp de 5 minute, urmate de 30 de cicluri de 94 ° C timp de 30 s, 60 ° C timp de 45 s și 72 ° C timp de 1 minut și, în cele din urmă, extindere de 72 ° C pentru încă 10 minute. Reactivii RT au fost furnizați de Promega Corp. (Madison, SUA). Reactivii PCR provin de la Roche (Mannheim, Germania). Două seturi de grunduri au fost utilizate simultan în acest RT-PCR semicantitativ (Tabelul 1). S-au folosit diferite numere de cicluri PCR pentru a se asigura că atât amplificarea cIAP2 cADN-ului β-actinei a fost în intervalul exponențial. Primeri pentru β-actină au fost adăugați în a șasea rundă a fiecărei amplificări PCR.
Tabel în dimensiune completă
După amplificare, 10 pl din amestec au fost separate pe un gel de agaroză 1,5% colorat cu bromură de etidiu. Gelurile au fost vizualizate sub lumină UV, densitatea, precum și raportul dintre cIAP2 și β-actină au fost măsurate și analizate utilizând software-ul Quantitation, versiunea 4 Windows și Macintosh (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, SUA).
Izolarea proteinelor și analiza Western blot
Detectarea apoptozei
Adipocitele apoptotice din 15 probe împerecheate au fost detectate prin etichetarea terminală mediată de deoxinucleotidil transferază a dUTP-fluorescein nichel-end (TUNEL) conform protocolului producătorului. Indicii apoptotici au fost obținuți numărând 200 de adipocite în cel puțin patru câmpuri vizuale la microscopul cu lumină.
analize statistice
Datele au fost analizate folosind pachetul statistic de științe sociale (SPSS) și li s-a atribuit o valoare P mai mică de 0,05. Deoarece expresia cIAP2 în țesutul adipos nu a fost distribuită în mod normal, acestea sunt prezentate ca mediană (interval intercuartil) în text și tabel. Un test Wilcoxon cu rang semnat a fost utilizat pentru a compara diferențele de expresie dintre SC și OM; Testul Mann-Whitney a fost utilizat pentru a compara diferențele specifice depozitelor între copii și adulți. Corelațiile au fost calculate prin testul coeficientului de corelație al lui Spearman.
Rezultatul
Comparațiile în perechi ale expresiei ARNm cIAP2 din țesutul adipos SC și OM au fost cuantificate prin RT-PCR așa cum se arată în Figura 1a. A existat o variație marcată a nivelului de exprimare între indivizi, în special în OM (Figura 1b). Cu toate acestea, a existat o diferență semnificativă specifică depozitului în nivelul de expresie al ARNm cIAP2 (Tabelul 2). ARNm cIAP2 a fost de 1,5 ori mai mare în OM comparativ cu țesutul adipos SC (OM> SC la 20 din 23 de subiecți; P 
Diferențe specifice depozitului în expresia ARNm cIAP2. a) Exemplu de analiză a gelului de agaroză după RT-PCR a probelor de țesut adipos SC și OM pereche de la cinci indivizi. (b) Graficele Scatter arată că expresia ARNm cIAP2 în SC și OM adipose ale tuturor indivizilor. Barele orizontale indică mediana.
Imagine la dimensiune completă
Tabel în dimensiune completă
Western blots sunt prezentate în Figura 2. În conformitate cu expresia ARNm, nivelurile de proteină cIAP2 au fost mai mari în OM comparativ cu SC (OM> SC la nouă din 10 subiecți, P
Diferențe specifice depozitului în expresia proteinei cIAP2. (a) Exemplu de imunobloti de proteine cIAP2 din țesutul adipos SC și OM de la patru indivizi. (b) Graficele împrăștiate prezintă expresia proteinei cIAP2 în adipozele SC și OM a 10 indivizi. Barele orizontale indică mediana.
Imagine la dimensiune completă
Analiza imunohistochimică nu a arătat nicio diferență între SC și OM în indicii apoptotici ai adipocitelor (indici apoptotici 14, care au demonstrat o expresie mai mare a ARNm cIAP2 în OM decât în adipocitele SC adulte. Cu toate acestea, studiul lor s-a concentrat doar pe nivelurile de ARNm, deoarece expresia ARNm nu întotdeauna reflectă expresia proteinei sau concentrația de proteine procesate complet, am extins observația confirmând că diferența principală între țesutul adipos OM și SC apare și la nivelul proteinei.
CIAP2 a fost identificat inițial ca o proteină care se leagă de complexul de semnalizare a receptorului TNF, sugerând că acesta poate fi implicat în reglarea semnalizării TNFa. Supraexprimarea proteinei cIAP2 umane poate suprima moartea celulară indusă de diverși stimuli. Comparativ cu adipocitele izolate umane, preadipocitele cultivate în mediu conținând ser au niveluri mai ridicate de ARNm cIAP2 și, de asemenea, susceptibilitate mai mică la apoptoza indusă de TNFα. 14, 15, 17 Prin urmare, expresia cIAP2 în țesutul adipos SC și OM poate reflecta susceptibilitatea specifică depozitului la apoptoză și astfel pierderea sau depunerea țesutului adipos.
Creșterea și distribuția țesutului adipos uman depinde în mare măsură de vârstă și sex. Acumularea de celule adipoase specifice sitului la o vârstă fragedă poate contribui la depunerea depozitelor de grăsime specifice depozitului la o vârstă mai târzie. Multe observații sugerează că obezitatea este programată în perioadele critice de dezvoltare, de exemplu, adipozitatea în copilăria timpurie urmează slab până la maturitate, în timp ce adipozitatea în adolescență crește riscul de obezitate persistentă și complicațiile acesteia. În acest studiu, am comparat modelul de expresie cIAP2 la copii cu adulți. Rezultatele au arătat că diferența specifică depozitului în expresia ARNm cIAP2 a fost consecventă la copii și adulți. Expresia ARNm CIAP2 nu a prezentat modificări semnificative dependente de vârstă. De asemenea, nu au existat legături semnificative între expresia ARNm cIAP2 și IMC sau sex. Interesant este că diferența dintre OM și SC a fost mai pronunțată la copii. Deoarece țesutul adipos visceral este limitat în copilărie, în general, o expresie mai mare la copii poate reflecta doar un câștig net în țesutul adipos visceral în timpul creșterii și, prin urmare, o susceptibilitate mai mică la apoptoză. Această posibilitate este susținută de observația că nivelurile de expresie NIAP în preadipocitele abdominale subcutanate sunt de 3-5 ori mai mari după pierderea în greutate, ceea ce favorizează recuperarea în greutate. 20
În acest studiu, nu am putut demonstra nicio diferență în rata bazală a apoptozei între adipocite din cele două depozite. Explicația probabilă este că indicii apoptotici bazali au fost prea mici pentru cuantificare și comparație exactă. Această viziune este susținută de faptul că Prins și colab. 17 a arătat că indicele apoptotic bazal al celulelor adipoase cultivate în mediu conținând ser a fost foarte scăzut, independent de metoda utilizată. Cu toate acestea, nu putem exclude faptul că metoda utilizată este prea insensibilă pentru a demonstra o diferență în indicii de apoptoză între două situsuri de țesut adipos, care s-ar putea corela cu o diferență în expresia cIAP2. În plus, trebuie investigat rolul fiziologic al diferenței locale în expresia cIAP2 în țesutul adipos.
În rezumat, am comparat expresia ARNm cIAP2 în țesutul adipos SC și OM la 12 copii și 11 adulți. O expresie relativă mai mare în OM în comparație cu țesutul adipos SC a fost găsită la copii și adulți. Acest lucru sugerează că expresia diferențială a cIAP2 între depozite se poate datora proprietăților intrinseci ale celulelor din cele două depozite. O diferență mai pronunțată a depozitelor pediatrice la copii poate reflecta o creștere netă a țesutului adipos visceral în timpul creșterii.
Mulțumiri
Această lucrare a fost susținută de Fondul de cercetare științifică al Comitetului pentru educație din Jiangsu (320012) și Consiliul suedez de cercetare medicală (19X-05708). Mulțumim dr. Xu Xiaoqun, Lou Yao, Chen Yijiang și prof. Peter Naredi pentru furnizarea unui eșantion de țesut adipos pentru aceste studii și profesorul Tommy Olsson pentru discuții fructuoase.