descendenților

  • obiecte
  • abstract
  • Fundal:
  • scopul:
  • metode:
  • rezultatele:
  • concluzie:
  • introducere
  • Materiale și metode
  • Animale și dietă
  • Testul de consum de alimente, creșterea în greutate și toleranță orală la glucoză
  • Colecția de țesuturi
  • Expresia genelor hipotalamice
  • Analiza concentrației de folat
  • Analiza hipotalamică globală a metilării ADN-ului
  • Analize statistice
  • Rezultatul
  • Aportul alimentar, creșterea în greutate și răspunsul la glucoză
  • Expresia genelor hipotalamice
  • Starea acidului folic
  • Starea globală de metilare
  • discuţie

obiecte

  • Expresia genelor
  • hipotalamus
  • Suplimente nutritive
  • Obezitatea

abstract

Fundal:

Șobolanii Wistar hrăniți cu multivitamine (de 10 ori AIN-93G, HV) în timpul sarcinii cresc caracteristicile sindromului metabolic la descendenți atunci când sunt înțărcați din dieta recomandată de vitamine (RV).

Pentru a determina dacă efectele nutriției gestaționale HV asupra fenotipurilor obezogene la descendenți se datorează controlului hipotalamic modificat al comportamentului de hrănire și dacă aportul lor crescut de alimente poate fi prevenit hrănindu-le în dietele HV sau folate (de 10 ori folat, HFol).

metode:

Descendenții bărbaților hrăniți cu dieta HV în timpul sarcinii înțărcați din dieta RV, HV sau HFol au fost comparați cu cei născuți de mamele RV și înțărcați din dieta RV timp de 29 de săptămâni. Aportul alimentar timp de 72 de ore și greutatea corporală au fost măsurate de două ori pe săptămână și, respectiv, săptămânal. Răspunsul glucozei la doza de glucoză a fost măsurat la 18 săptămâni după înțărcare. Expresia genelor hipotalamice a neuropeptidelor legate de hrănire, inclusiv neuropeptida Y, proopiomelanocortina (POMC), receptorul insulinei, receptorul leptinei, factorul neurotrofic derivat din creier (BDNF), receptorii dopaminei (DopaR1/2/5) și serotonina (2A)), precum și deoarece metilarea globală a ADN-ului și concentrațiile de folat din creier și plasmă au fost măsurate la 29 de săptămâni după înțărcare.

rezultatele:

Nutriția cățelușului HV sau HFol a crescut concentrațiile de folat în creier și plasmă și a prevenit creșterea consumului de alimente (5%, P = 0,03), greutatea corporală (8%, P = 0 0006) și răspunsul glucozei la încărcarea glucozei (36%, P = 0, 02) găsit la cei care au hrănit dieta RV. Expresia POMC anorexigenică (P = 0,004) și BDNF (P = 0,02) a fost mai mare și DopaR1 a fost mai mică (P = 0,06) la puii hrăniți cu dietă HV. Dieta cu pui HFol a adus parțial BDNF la nivelul de control (P = 0,02) și a redus SeroR2A (P = 0,008). Expresia altor gene nu a fost afectată. Metilarea globală a ADN-ului a fost similară între grupurile de dietă.

concluzie:

Fenotipul obezogen la descendenți din cuiburi hrănite cu HV este prevenit prin hrănirea furajelor pentru HV sau HFol, probabil datorită modularii ulterioare a mecanismelor de reglare a aportului alimentar după înțărcare.

Dieta consumată în timpul sarcinii și a vieții postnatale timpurii formează traiectoria de dezvoltare a descendenților. 1, 2 Deși vitaminele contribuie la toate etapele dezvoltării, 3 efectele consumului de multivitamine depășesc cerințele (dar la niveluri non-toxice) în timpul sarcinii ca determinanți ai fenotipurilor fiziologice ale descendenților au primit puțină atenție. Am arătat recent că hrănirea unei diete care conține de 10 ori conținutul recomandat de multivitamine (multivitamine ridicate (HV)) la șobolani Wistar în timpul sarcinii duce la creșterea aportului de alimente, obezitate și caracteristicile sindromului metabolic la bărbații adulți de 4 și 5 femele. înțărcat pe dieta recomandată de vitamine (RV). Deoarece hipotalamusul este un regulator important al consumului de alimente și al controlului apetitului 6, se poate presupune că o dietă bogată în alcool modifică dezvoltarea hranei neurocitelor la descendenți, rezultând un fenotip obezogen. Reglarea dezordonată a căilor dietetice poate afecta creșterea și metabolismul, ceea ce la rândul său duce la dezvoltarea sindromului metabolic mai târziu în viață. 7, 8

Materiale și metode

Animale și dietă

Desen schematic al studiului A ) proiectarea a b ) protocol pentru descendenții masculi de la 0 la 29 de săptămâni după înțărcare. Abrevieri dietetice: dieta RV, AIN-93G cu vitamine recomandate; HV, de 10 ori cantitatea de amestec multivitaminic recomandat; HFol, RV + conținut de folat de 10 ori. Dietele consumate în timpul sarcinii marcate în fața liniei. Dietele consumate de descendenți marcate în spatele unei linii.

Imagine la dimensiune completă

Testul privind aportul alimentar, creșterea în greutate și toleranța orală la glucoză

Figura 1b prezintă protocolul de studiu. Aportul alimentar timp de 72 de ore a fost măsurat la fiecare 2 săptămâni de la 0 la 29 săptămâni după înțărcare. Greutatea corporală a fost măsurată la naștere și înțărcare, iar creșterea în greutate a fost calculată săptămânal de la 0 la 29 de săptămâni după înțărcare. Răspunsul glucozei la sonda glucozei (0,375 g glucoză per ml, 5 g glucoză per kg greutate corporală) a fost măsurat la 18 săptămâni după înțărcare. Șobolanii au fost postiti peste noapte timp de 10 ore inainte de sonda de glucoza. O probă de sânge a fost prelevată din vena cozii și glucoza inițială a fost analizată imediat folosind un glucometru comercial (MediSense Precision Xtra, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, SUA). După administrarea de glucoză, concentrațiile de glucoză din sânge au fost determinate 15 și 60 de minute mai târziu și s-a calculat aria incrementală de sub curbă.

Colecția de țesuturi

Creierele șobolanilor întregi au fost îndepărtate rapid după decapitare la 29 de săptămâni după înțărcare și imediat înghețate pe gheață uscată și apoi depozitate la -80 ° C. Creierele au fost decongelate pe gheață și părțile dreapta și stânga ale hipotalamusului au fost separate separat folosind metoda descris mai sus. 14 Chiasma optică a fost utilizată pentru a defini hipotalamusul anterior. Acest lucru trece prin comisia din față, care a fost utilizată ca limită orizontală. Linia dintre hipotalamusul posterior și corpurile de mamifere a fost considerată partea caudală. Blocurile hipotalamice disecate conțineau nucleele complexului prepopeptic, supraoptic, paraventricular, anterior, suprachiasmatic, dorsomedial, ventromedial, arc, mamifer, posterior și lateral. Partea dreaptă a hipotalamusului a fost utilizată pentru exprimarea relativă a genelor și partea stângă pentru starea de metilare a ADN-ului. Partea stângă a creierului rămas a fost utilizată pentru a măsura concentrația de folat. Sângele carcasei a fost colectat și centrifugat și 0,5% acid ascorbic a fost adăugat în plasmă pentru a preveni oxidarea folatului.

Expresia genelor hipotalamice

Fiecare hipotalamus disecat a fost omogenizat utilizând un omogenizator de ruptor tisular (Qiagen Tech., Mississauga, ON, Canada). ARN din probe omogenizate a fost izolat folosind reactivul Trizol și extracția cloroformului conform protocolului producătorului (Invitrogen, Grand Island, NY, SUA) și cuantificat cu Nanodrop 1000. ADNc a fost sintetizat folosind un kit de arhivă ADNc de mare viteză în ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA) Gene Amp PCR System 2700.

RT-PCR în timp real a fost efectuat pe un sistem de detectare a secvenței ABI PRISM 7000 utilizând teste Taqman pentru următoarele gene achiziționate de la ABI: neuropeptidă Y (Nr. De Cat. Rn01410146_m1); pro-opiomelanocortină (POMC; Nr. Cat. Rn00595020_m1); receptor de insulină (nr. cat. Rn00567070_m1); receptorul leptinei (nr. cat. Rn01433205_m1); factor neurotrofic cerebral (BDNF; nr. cat. Rn02531967_s1); receptorul dopaminei 1 (DopaR1; nr. cat. Rn03062203_s1); receptorul dopaminei 2 (DopaR2; nr. cat. Rn00561126_m1); receptorul dopaminei 5 (DopaR5; nr. cat. Rn00562768_s1); receptorul serotoninei 1A (SeroR1A; nr. cat. Rn00561409_s1); receptorul serotoninei 2A (SeroR2A; nr. cat. Rn01468302_m1); receptorul serotoninei 2C (SeroR2C; nr. cat. Rn00562748_m1). Condițiile ciclului au fost 50 ° C timp de 2 minute, 95 ° C timp de 10 minute, 40 cicluri la 95 ° C timp de 15 secunde și 60 ° C timp de 1 minut. Metoda relativă de cuantificare a fost realizată utilizând gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază (nr. De Cat. Rn99999916_s1) ca control endogen, care a fost selectat prin pre-screening pentru cea mai mică variație a sa. Rezultatele au fost exprimate ca schimbare de pliuri utilizând metoda 2- AATCT 15 și analizate folosind software-ul ABI DataAssist versiunea 3.0.

Analiza concentrației de folat

Concentrațiile plasmatice și ale folatului cerebral au fost determinate printr-un test microbiologic de microplacă folosind Lactobacillus casei. 16, 17

Analiza hipotalamică globală a metilării ADN-ului

ADN-ul a fost izolat folosind protocolul prezentat în trusa DNeasy Blood and Tissue (Qiagen Tech.). Pentru a determina concentrația, s-au calculat două valori spectrofotometrice ale probelor de ADN, care aveau un raport A 260 - 280 între 1,8 și 2,0 și nu conțineau contaminarea cu ARN și proteine.

Starea globală de metilare a ADN-ului genomic hipotalamic a fost determinată prin metoda de acceptare in vitro a metilului, așa cum este descris mai sus. 18, 19 Această analiză implică 3 H-metil-S-adenosilmetionină (New England Nuclear, Boston, MA, SUA) ca donator de metil mediat de Sss1 ADN metiltransferază (New England Biolabs, Pickering, ON, Canada). Se știe că capacitatea de acceptare a grupărilor metil de-a lungul genomului este asociată indirect cu încorporarea exogenă a 3H-metilului. Toate probele au fost analizate de două ori și întregul test a fost efectuat de două ori. CV-ul intra și inter-CV a fost de 5%.

Analize statistice

Efectele tratamentului asupra creșterii în greutate și a consumului de alimente de 72 de ore au fost analizate utilizând procedura modelului PROC MIXED în SAS (versiunea 9.2, SAS Institute Inc., Carey, NC, SUA), cu dieta gestațională, puii și timpul fiind principalul factori. Mediile la fiecare moment și pentru expresia genelor hipotalamice, starea folatului și răspunsul la glucoză au fost comparate printr-o analiză unidirecțională a varianței utilizând PROC GLM urmată de testul post-hoc al lui Tukey. Au fost observate diferențe semnificative pentru P

Aportul alimentar după 72 de ore de descendenți masculi de la 0 la 29 de săptămâni după înțărcare. Abrevieri dietetice: dieta RV, AIN-93G cu vitamine recomandate; HV, de 10 ori cantitatea de amestec multivitaminic recomandat; HFol, RV + conținut de folat de 10 ori. Dietele consumate în timpul sarcinii marcate în fața liniei. Dietele consumate de descendenți marcate în spatele unei linii. Dieta (P = 0,033), timpul (P ab Semnificativ diferit în funcție de modelul de măsurare repetată PROC MIXED. Valorile sunt medii ± sem, n = 12-14 pe grup.

Imagine la dimensiune completă

Greutatea corporală a descendenților de la 0 la 29 de săptămâni după înțărcare. Abrevieri dietetice: dieta RV, AIN-93G cu vitamine recomandate; HV, de 10 ori cantitatea de amestec multivitaminic recomandat; HFol, RV + conținut de folat de 10 ori. Dietele consumate în timpul sarcinii marcate în fața liniei. Dietele consumate de descendenți marcate în spatele unei linii. Creșterea în greutate: dietă (P = 0 0006), timp (P ab Semnificativ diferit în conformitate cu modelul de măsurare repetată PROC MIXED. Valorile sunt medii ± sem, n = 12-14 pe grup.

Imagine la dimensiune completă

Răspunsul glucozei din sânge la încărcătura de glucoză (5 g glucoză per kg de greutate corporală) ca zonă sub curba (iAUC) a descendenților masculi la 18 săptămâni după înțărcare. Abrevieri dietetice: dieta RV, AIN-93G cu vitamine recomandate; HV, de 10 ori cantitatea de amestec multivitaminic recomandat; HFol, RV + conținut de folat de 10 ori. Dietele consumate în timpul sarcinii marcate în fața liniei. Dietele consumate de descendenți marcate în spatele unei linii. ab P = 0,02 prin analiza unică a varianței urmată de testul post-hoc al lui Tukey. Valorile sunt medii ± sem, n = 8-12 pe grup.

Imagine la dimensiune completă

Expresia genelor hipotalamice

Dieta animală de HV, dar nu HFol, a dat expresie POMC pentru a controla nivelurile la descendenții adulți de la mamele HV (P = 0,004) (Figura 5a). Puii HV cu dieta HV au adus expresia BDNF la nivelurile de control, dar dieta de decolteare HFol a atenuat doar reducerea expresiei induse de HV (P = 0,02) (Figura 5a). Doar dieta pui HFol a redus expresia SeroR2A în comparație cu descendenții HV înțărcați de la puii RV (P = 0,008) (Figura 5b). În cazul descendenților HV înțărcați în dieta puilor HV comparativ cu descendenții RV (P = 0,06), s-a observat o tendință de expresie mai mică a DopaR1 (Figura 5b). Sarcina sau sugarii nu au avut niciun efect asupra expresiei hipotalamice a altor gene.

Expresia genelor hipotalamice ( A ) neuropeptida Y (NPY), proopiomelanocortina (POMC), receptorul insulinei (InsR), receptorul leptinei (LepR) și factorul neurotrofic al creierului (BNDF) și ( b ) receptorii dopaminei (DopaR1/R2)/R5) și receptorii serotoninei (SeroR1A/2A/2C) la descendenții masculi la 29 de săptămâni după înțărcare. Abrevieri dietetice: dieta RV, AIN-93G cu vitamine recomandate; HV, de 10 ori cantitatea de amestec multivitaminic recomandat; HFol, RV + conținut de folat de 10 ori. Dietele consumate în timpul sarcinii marcate în fața liniei. Dietele consumate de descendenți marcate în spatele unei linii. ab Analiza unică a varianței semnificativ diferită, urmată de testul post-hoc al lui Tukey. Valorile sunt medii ± sem, n = 4-7 pe grup.

Imagine la dimensiune completă

Starea acidului folic

Nivelurile de folat din creier (Figura 6a) și plasmă (Figura 6b) nu au fost afectate de dieta barajului, dar au fost crescute de catelul HV sau HFol.

O nouă observație a studiului nostru este că căile de hrănire hipotalamică răspund la conținutul de vitamine din alimente după înțărcare. Hrănirea puilor HV a restabilit expresia POMC și BDNF pentru a controla nivelurile la descendenții maturi. Deoarece expresia acestor neuropeptide anorexigenice a fost normalizată, se poate presupune că conținutul de vitamine din dietă după înțărcare contribuie la remodelarea funcției hipotalamice atât la șobolanii maturi, cât și la cei în curs de dezvoltare. Mai mult, a existat o tendință de exprimare mai mică a DopaR1 la descendenții HV înțărcați din dieta HV comparativ cu descendenții martor. În nucleul hipotalamic ventromedial, eliberarea de dopamină este necesară pentru inițierea unei mese și este asociată pozitiv cu numărul și durata mesei. 27, 28 Prin reducerea probabilă a semnalizării dopaminei, o dietă de fisiune pentru HV poate oferi o anumită protecție împotriva consumului excesiv de alimente cauzat de o dietă gestațională pentru HV. Deși suntem primii care arată că creierul adult răspunde la vitamine, rezultatele noastre sunt justificate de raportul modificărilor hipotalamice ale genelor reglatoare ale consumului de alimente datorate interacțiunii dietelor materne și postînțărcare bogate în grăsimi la descendenții masculi.

Deși folatul s-a dovedit a fi un participant activ la reacțiile de metiltransfer, 12 diete gestaționale nu au fost afectate de metilarea globală nici după înțărcare. Cu toate acestea, acest lucru nu este surprinzător, deoarece studiile anterioare au raportat că metilarea ADN a genelor în absența unei modificări detectabile a metilării globale sugerează că modificările epigenetice sunt specifice site-ului. 33 În plus, dietele RV, HV și HFol din studiul nostru conțin cantități mari de colină, care este un alt factor care afectează metilarea ADN-ului, 34, 35 și poate avea o detectare latentă a efectului folatului asupra metilării. Metabolismul colinei și al altor vitamine ale grupului metil (adică folatul, vitamina B6 și B12) este strâns legat. 36

Slăbiciunea semnificativă a studiului rezultă din lipsa măsurării expresiei genelor în diferite stadii de maturitate. Prin urmare, nu știm în ce stadiu de maturare a avut loc o schimbare a hipotalamusului după mâncare după înțărcare. În plus față de genele hipotalamice, măsurarea genelor în zone ale creierului implicate în recompensă și motivație poate contribui la o înțelegere mai completă a impactului general al dietei asupra reglării aportului alimentar. Șoarecii hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi (60% calorii din grăsimi) după înțărcare s-au dovedit a avea o expresie mai scăzută a genei receptorului opioid, care afectează circuitele de recompensă din regiunea ventrală a tegmentalului, nucleului accumbens și cortexului prefrontal. 37

În concluzie, fenotipul obezogen la descendenți din cuiburi hrăniți cu HV se poate datora controlului hipotalamic modificat al comportamentului de hrănire, dar poate fi prevenit hrănindu-i cu pui HV sau HFol.