abstract

Principalul

Leziunile fibroase maxilo-faciale cuprind un grup de tulburări faciale și maxilare caracterizate prin înlocuirea osului cu o matrice benignă de țesut conjunctiv cu cantități variabile de substanțe mineralizate. Fibromul osmotic și displazia fibroasă sunt cele mai frecvente leziuni de fibroză care pot fi asociate cu tulburări cosmetice și funcționale semnificative; deoarece prezintă modele diferite de progresie a bolii, este important să se facă distincția între ele. Datorită riscului său de recurență, fibromul osificant trebuie complet enucleat din osul înconjurător. 1, 2, 3 În schimb, pacienții cu displazie fibroasă trebuie tratați în funcție de starea clinică. Creșterea displaziei fibroase monostotice tinde de obicei să se stabilizeze la atingerea maturității scheletice; prin urmare, intervenția chirurgicală la copii și adolescenți trebuie amânată cât mai curând posibil. 1, 2, 3, 4 Terapia cu bifosfonați este utilizată la pacienții cu displazie fibroasă simptomatică. Cazurile tipice de osificare fibroasă și displazie fibroasă a feței și maxilarului se caracterizează prin aspect radiologic și histologic. Cu toate acestea, aceste leziuni prezintă adesea o dilemă diagnostică din cauza incertitudinilor privind semnificația diagnosticului caracteristicilor radiologice și histologice specifice; diagnosticarea exactă a acestor leziuni poate fi, prin urmare, dificilă. 1, 2, 3

Histologic, fibroblastele stromale produc matrice osoasă fără dovezi morfologice ale celulelor osteoblastice la periferia spiculelor osoase în displazia fibroasă. 4 Studiile ultrastructurale și biochimice sugerează că componenta fibroblastică a displaziei fibroase este legată de linia osteogenă; 7, 8, dar dovezi biologice moleculare precise în acest scop nu au fost încă furnizate. Recent, diferențierea osteogenică față de celulele stem mezenchimale s-a dovedit a fi determinată de factorul de transcripție Runx2. 9, 10 Prin urmare, diferențele în expresia Runx2 și a altor markeri osteogeni pot permite distincția histologică între displazia fibroasă și fibromul osmotic.

O mutație a subunității alfa a genei proteinei G stimulatoare (GNAS) din codonul Arg201 a fost identificată în țesuturile leziunilor pacienților cu sindrom McCune-Albright. Ulterior, mutațiile GNAS au fost observate în displazia fibroasă extragnatică fără sindrom McCune-Albright, 12, 13, 14, 15, care a recunoscut-o ca un marker al displaziei fibroase. Cu toate acestea, prezența sau absența mutațiilor GNAS în displazia fibrozei gatatice nu a fost studiată.

În acest studiu, am analizat expresia markerilor osteogeni și a mutațiilor GNAS în cazurile de displazie a fibrozei gnatului și de osificare a fibromului cu caracteristici radiologice și histologice tipice pentru a identifica markeri importanți care permit diferențierea între cele două entități ale bolii.

Materiale și metode

Subiecte experimentale

Nouă probe de displazie fibroasă, cinci din fibroame osifiante, două din displazie osteofibrială și trei din oase normale au fost decalcificate în soluție EDTA, fixate în formalină și încorporate în parafină. Probele de țesut utilizate în acest studiu au fost obținute în conformitate cu liniile directoare ale Comisiei mixte pentru investigații clinice a Facultății postuniversitare de stomatologie și medicină de la Universitatea din Osaka. Nouă displazii fibroase au inclus cinci cazuri gnatice monostotice și trei cazuri extragnatice monostotice și mono-poliostotice. Toate cele cinci cazuri de osificare a fibromului au fost derivate din regiunea gnatului. Toate aceste leziuni au fost diagnosticate ca cazuri tipice pe baza criteriilor clinice, radiologice și histologice. Datele clinice asociate cu aceste cazuri sunt rezumate pe scurt în tabelul 1. Secțiunile histologice ale acestor probe tăiate la 5 μm au fost colorate cu hematoxilină și eozină și supuse procedurii de imunoperoxidază.

Tabel în dimensiune completă

imunohistochimie

Colorarea imunohistochimică a fost efectuată prin metoda peroxidază a complexului streptavidină-biotină (sABC) cu un sistem sABC anti-șoarece sau anti-iepure de la Dako (Glostrup, Danemarca). Anticorpii principali utilizați în acest studiu au fost după cum urmează: anticorp monoclonal murin anti-Runx2 (MBL Co., Ltd., Nagoya, Japonia), 16 anticorpi policlonali cu iepure anti-dentină matrice proteină 1 (DMP1), 17 osteocalcină murină anti-bovină anticorpi monoclonali (clonă; OC4-3) (TaKaRa Biomedicals, Shiga, Japonia) și anticorpi anti-osteopontin policlonali anti-șoarece de iepure (IBL Co., Ltd., Gunma, Japonia). Recuperarea antigenului s-a efectuat prin digestia tripsinei pentru imunotainarea osteocalcinei și DMP1 și încălzirea cu tampon citrat pentru imunotestarea Runx2 și osteopontina. Secțiunile au contrastat ușor cu verde metilic. Serul IgG de șoarece sau iepure (Dako) a fost utilizat ca anticorp primar ca martor negativ, oferind rezultate negative uniforme.

Polimerază Reacție în lanț Polimorfism - Lungime de restricție (PCR-RFLP)

secvențierea

Produsele PCR amplificate cu 88-bp amplificate cu primerul PNA au fost purificate prin electroforeză în gel de agaroză 2%. Benzile au fost excizate și izolate din gel prin kituri de extracție ADN (QIAGEN). ADN-ul izolat a fost subclonat în vectorul pGEM-T Easy (Promega Co, Madison, WI, SUA). După purificare, secvențierea a fost efectuată folosind primerii vectoriali SP6 și T7. Zece clone per leziune au fost analizate folosind un sequencer automat ADN model 373 (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA). Astfel, toate produsele amplificate cu PCR au fost secvențiate pentru a confirma prezența mutației.

Rezultatul

Constatările clinico-patologice și radiologice ale pacienților

Datele clinice ale pacienților cu displazie fibroasă și fibrom osificant sunt prezentate în Tabelul 1. Nouă displazii fibroase și cinci fibroame osificante prezentate ca mărire a oaselor afectate și cinci displazii cu fibroză fibroasă și cinci fibroame osificante au prezentat asimetrie facială. Displazia radiologică cu fibroză a gnatului a arătat opacitate radioactivă omogenă cu amestec de sticlă măcinată în osul normal înconjurător (Figura 1a), în timp ce fibromul osificant a apărut ca o leziune opacă mixtă radioactivă și radioactivă uniloculară cu limite bine definite (Figura 1d). ). Histologic, displazia fibrozei gnatului este compusă dintr-un os tisular de formă neregulată într-o stromă fibroasă vascularizată de celulită variabilă (Figura 1b și c). Spiculele osoase țesute sunt distribuite uniform în toată leziunea și prezintă diferite forme (Figura 1b și c). Fibromele osmotice au prezentat structuri calcificate proeminente (cuburi și cementoli) care au apărut sub formă de osteoid eosinofil sau bazofil sau sferoizi osoși în stroma densă a celulei medii (Figura 1e și f). Astfel, leziunile care și-au îndeplinit criteriile clinice, radiologice și histologice tipice au fost utilizate în acest studiu.

displazie

Imagine la dimensiune completă

Constatări imunohistochimice ale displaziei fibroase și ale fibromului osmotic

Descoperirile imunohistochimice din displazia fibrozei extranatice și a gnatului și fibromul osmotic sunt prezentate în Figura 2. Atât în ​​displaziile fibrative, cât și în fibromele osifiante, s-a observat colorarea Runx2 în nucleii celulelor fusului în țesuturile conective fibroase, precum și în celulele de pe suprafața celulelor mineralizate. structuri (Figura 2a - c). În mod similar, osteopontina a fost detectată în jurul periferiei structurilor calcificate în ambele leziuni (Figura 2d - f). Imunoreactivitatea puternică împotriva osteocalcinei a fost distribuită în structurile calcificate în displazia fibroasă (Figura 2g și h), în timp ce numai imunoreactivitatea slabă a fost vizibilă în fibromul osmotic (Figura 2i). DMP1 a fost prezent în mod specific în matricea calcificată care înconjoară celulele asemănătoare osteocitelor atât în ​​displazia fibroasă, cât și în fibromul osmotic (Figura 2j-1). Astfel, nu a existat nicio diferență semnificativă între displazia fibroasă și fibromul osmotic în distribuția matricei osoase a oricărei proteine ​​testate, cu excepția osteocalcinei.

Imagine la dimensiune completă

Detectarea mutației GNAS în displazia fibroasă și în fibromele izolate prin PCR-RFLP

Probele de ADN din os normal (Figura 3a, benzile 1-3, 7-9) și displazia osteofibrială (Figura 3a, benzile 4, 5, 10, 11) au fost utilizate ca martori negativi. 18 Când PCR a fost efectuată fără PNA, un fragment amplificat de 88 bp a fost generat în controale negative. Prin adăugarea de PNA la PCR, intensitatea benzilor amplificate a fost redusă cu aproximativ 40 până la 60%. După tratamentul cu Eag I, fragmentele amplificate de 88 bp au fost complet digerate în două fragmente de 74 și 14 bp, indiferent dacă a fost prezent sau nu PNA (Figura 3a, benzile 1-5, 7-11). Analiza ulterioară a secvenței nu a relevat nicio mutație GNAS în aceste probe de ADN (datele nu sunt prezentate).

Imagine la dimensiune completă

O probă de ADN din blocul de parafină al displaziei fibroase poliostotice extragnatice (pacientul nr. 3) a fost utilizată ca control pozitiv. În absența PNA, benzile neclivite de 88-bp și 74-bp corespunzătoare alelelor mutante și de tip sălbatic au fost vizibile după digestia Eag1 (Figura 3a, banda 12). În prezența PNA, numai banda neclivită de 88 bp a fost vizibilă după scindarea EagI, și nu banda scindată de 74 bp (Figura 3a, banda 6). Aceste rezultate arată amplificarea selectivă a alelelor mutante în prezența PNA. 20

Analiza PCR a fost efectuată pentru patru displazii fibroase extragnatice, cinci displazii fibroze fibroase și cinci fibroame osmotice. În toate cele nouă cazuri de displazie de fibroză extragnatică sau de gnat, fragmentele de 88-bp digerate cu Eag I nu au fost amplificate (Figura 3b, căile 1-4: displazie fibroasă extragnatică; 5-9: displazie de fibroză a gnatului). În schimb, tratamentul Eagle cu cinci mostre de fibrom osificant a dus la scindarea completă a fragmentelor 74 și 14 pb (Figura 3b, benzile 10-14). Analiza secvenței a relevat mutații GNAS în codonul Arg201 în toate cele nouă cazuri de displazie fibroasă, dar în niciunul dintre eșantioanele de fibrom osificant (Tabelul 1).

discuţie

Fibromul osificant și displazia fibroasă prezintă adesea o dilemă diagnostică atât pentru medici, cât și pentru patologi, datorită similitudinii lor radiografice și histologice. Voytek și colab. 21 au raportat că fibromele osmotice semnificative nu s-au putut distinge complet de displazia fibroasă din studiile lor histologice. Aceste leziuni au prezentat, de asemenea, o suprapunere radiografică semnificativă. Au sugerat că, datorită acestei similitudini, fibromul osificant și displazia fibroasă ar putea fi considerate boli la ambele capete ale unui spectru morfologic. Un alt raport afirmă că fibromul osificant este mai degrabă o variantă a displaziei fibroase decât o entitate diferită a bolii. Acest studiu demonstrează în mod clar că analiza imunohistochimică a osteocalcinei și analiza PCR a mutațiilor GNAS sunt metode utile în diferențierea dintre cele două și, în plus, sugerează că este probabil să fie entități diferite ale bolii.

Displazia fibroasă este caracterizată histologic prin fibroblaste stromale care produc matrice osoasă fără dovezi morfologice ale celulelor osteoblastice la periferia spiculelor osoase. Natura osteoblastică a acestor celule fibroblastice a fost sugerată prin analiza microscopiei electronice, care arată căptușeala osteoblastelor anormale cu un fibroblast similar în jurul țesutului imatur, 7 și analiza biochimică, care arată o creștere a activității fosfatazei alcaline în celulele care umple zonele fibrotice. displazie fibroasă. În acest studiu, nucleele celulelor fibroblaste, precum și celulele de suprafață osoasă, au arătat o expresie puternică a Runx2, un factor important de transcripție pentru linia osteogenă, sugerând că aceste celule sunt precursori osteogeni. În mod similar, celulele fibroblaste din fibromul osificant au arătat, de asemenea, o expresie puternică a Runx2 în nucleu. Astfel, ambele leziuni ar putea fi interpretate ca boli celulare în linia osteogenă.

Analiza imunohistochimică a markerilor osteogeni precum osteopontina și DMP1 nu a arătat prea multe diferențe între displazia fibroasă și fibromul osmotic; cu toate acestea, imunohistochimia osteocalcinei a arătat o diferență semnificativă între cele două. Osteopontina, osteocalcina și DMP1 sunt proteine ​​abundente necolagene ale matricei osoase normale. 23, 24, 25 Osteocalcina, cea mai abundentă proteină non-colagenică 24, este distribuită în osul normal 25 și s-a dovedit a fi un regulator negativ al formării osoase prin tehnologia knockout genică. Abundența osteocalcinei în displazia fibroasă și deficiența sa în fibromul osificant sugerează că materialul calcificat în displazia fibroasă este mai asemănător cu osul normal decât în ​​fibromul osificant. Această diferență marcată poate indica diferențe în formarea osoasă și diferențierea osteoblastelor între cele două leziuni.

Analiza mutațiilor GNAS la codonul Arg201 sa dovedit a fi utilă pentru a distinge între fibroza osificatoare și displazia fibroasă. Natura somatică a mutațiilor din displazia fibroasă face dificilă identificarea acestora, deoarece mutațiile nu sunt prezente în toate celulele pacienților afectați, chiar și în organele afectate. Prin urmare, metoda de prindere a PNA a fost utilizată în acest studiu. 15, 20 Secvențierea fragmentelor amplificate cu PCR a confirmat acuratețea analizei PCR utilizând PNA, sugerând că analiza PCR utilizată în acest studiu poate fi o modalitate utilă și ușor disponibilă de a detecta mutațiile GNAS în codonul Arg201. .

Recent, au fost publicate modificări ale genei supresoare tumorale HPRT2 în fibromul osmotic. Secvențierea directă a HPRT2 a relevat mutații în două din cele patru cazuri de osificare a fibromului. Aceste descoperiri sugerează că mutația HPRT2 nu este comună în dezvoltarea fibromului osificant și, prin urmare, nu poate fi utilizată ca marker pentru diagnostic.

În concluzie, displazia fibroasă și fibromul osificant sunt entități similare bolii prin faptul că ambii prezintă markeri în concordanță cu descendența osteogenică în celulele lor de tip fibroblast stromal. Cu toate acestea, ele diferă în ceea ce privește compoziția exactă a matricei osoase, dovadă fiind imunohistochimia osteocalcinei. În cele din urmă, analiza PCR cu PNA pentru mutațiile GNAS în codonul Arg201 este o metodă potențial utilă pentru a distinge între cele două.