obiecte

abstract

Galactozemia clasică este o tulburare recesivă moștenită a metabolismului galactozei cauzată de o deficiență a enzimei galactoză-1-fosfat uridiltransferază (GALT), care este cauzată de mutații ale genei GALT. În acest studiu, 56 de pacienți turci diagnosticați cu galactozemie au fost examinați pentru mutațiile genei GALT utilizând microarrays de secvență Affymetrix. Unsprezece tipuri de mutații au fost identificate la acești pacienți, inclusiv două mutații noi (R258G și G310fsX49) și nouă mutații recurente. În acest studiu, am identificat șase pacienți care au fost homozigoti pentru mutația E340 * și pentru substituții silențioase N314D, L218L (varianta Duarte-1). Haplotipurile E340 *, N314D și L218L au fost raportate doar la pacienții turci, sugerând că mutația E340 * este specifică populației noastre și poate fi răspândită de predecesorul turc. Alela Duarte-1 a fost găsită la pacienți la o frecvență de 10,71%, în timp ce alela Duarte-2 nu a fost detectată. S-a constatat că alelele Duarte-1 și Duarte-2 sunt prezente la o frecvență de 2,3% și 1,4% în screeningul a 105 persoane sănătoase. Având în vedere toate mutațiile găsite, este foarte important să constatăm că exonii 6 și 10 ai genei GALT reprezintă 79% din toate alelele mutante din populația turcă. Cea mai frecventă mutație este Q188R cu o frecvență de 55, 35%.

frecvență

Galactozemia este o tulburare autosomală recesivă a metabolismului galactozei rezultată din activități insuficiente sau absente ale galactokinazei, galactozei-1-fosfat uridiltransferazei (GALT) și enzimelor UDP-galactoză-4'-epimerază, care joacă un rol în metabolismul galactozei în Leloira. Forma predominantă este galactozemia de tip clasic, care este cauzată de o reducere severă sau absența enzimei GALT și are o incidență de 1/40.000-60.000 la nou-născuții europeni. Au fost raportate peste 150 de mutații ale genei GALT. 3

Scăderea activității enzimei GALT duce la acumularea de gal-1P în diferite organe. Boala apare de obicei în primele zile de viață după ingestia laptelui matern sau a produsului. Cele mai vechi descoperiri clinice ale bolii sunt vărsăturile, diareea, incapacitatea de a prospera și icterul. Deși multe dintre aceste simptome dispar cu o dietă cu restricție de galactoză, complicațiile pe termen lung, cum ar fi retardul mental, tulburările de vorbire sau de învățare și insuficiența ovariană prematură la pacienții de sex feminin pot continua să persiste. 4

Galactozemia de tip I este clasificată în fenotipuri Duarte severe clasice și ușoare pe baza activității GALT reziduale. Galactozemia clasică este adesea asociată cu mutații S135L, Q188R și K285N în gena GALT. Modificarea funcțională neutră N314D a genei GALT este asociată cu galactozemia Duarte și este răspândită în rândul populațiilor din întreaga lume. Varianta Duarte-1 are activitate enzimatică GALT normală sau crescută, în timp ce varianta Duarte-2 are activitate enzimatică GALT scăzută. Alela Duarte-1 este asociată cu mutația N314D în dezechilibru de legare cu polimorfismul L218L. Alela Duarte-2 este asociată cu mutația N314D în dezechilibru de legare cu trei polimorfisme intronale IVS4nt-27 g-> c, IVS5nt-24 g-> aa IVS5nt + 62 g-> a și o ștergere a c-119 -> - 116delGTCA în zonele netraduse de 5 '. 6, 7 Tipul Duarte-1 nu provoacă nicio anomalie clinică sau biochimică, deoarece polimorfismul L218L crește rata de translație a proteinei N314D GALT. 5 Ștergerea regiunii 5'-netraduse-119 -> - 116delGTCA în regiunea promotoră a genei GALT (varianta Duarte-2) determină o reducere a transcripției genei GALT. 8

În acest raport, raportăm mutațiile genei GALT în 56 de cazuri de galactozemie din Turcia identificate prin resecvențierea microarray-ului ADN. În plus, 105 indivizi sănătoși au fost testați pentru a determina frecvența variantelor alelice Duarte-1 și Duarte-2 la populația turcă.

Materiale și metode

pacienți

Cincizeci și șase de pacienți turci cu galactozemie de la Universitatea Hacettepe, Departamentul de Pediatrie, Unitatea de Metabolism, au fost înscriși într-un studiu pentru a detecta mutațiile genei GALT folosind o metodologie de secvență microarray. S-a primit consimțământul scris al tuturor părților implicate. Pacienții cu galactozemie clasică au prezentat simptome tipice, cum ar fi eșec, vărsături, hepatosplenomegalie și insuficiență hepatică. Diagnosticul de galactozemie a fost suspectat de găsirea unui agent reducător care nu reacționează cu reactivii de glucoză oxidază și identificarea cromatografică a hârtiei zahărului.

Izolarea ADN și PCR

ADN-ul genomic a fost izolat din sângele periferic prin precipitare cu acetat de amoniu. Gena GALT a fost amplificată ca două fragmente prin PCR cu rază lungă de acțiune folosind primerii fragmentului 1F5'-CACGGCCCTGCAGATTTTCC-3 ', fragment-1R5'-CTTCATCACCCCCTCCCTGC-3' (lungimea produsului PCR 1348 bp) și fragment-2F5'-CAGCAAGGCTCT ', fragment-2R5'-AGTTGTAGCTGGAGCTATGC-3 '(lungimea produsului PCR 2878 bp). Toți primerii au fost proiectați utilizând software-ul de analiză Oligo Primer (Oligo versiunea 6.71, Molecular Biology Insights, Inc., Cascade, CO, SUA). Reacțiile PCR au fost efectuate timp de 32 de cicluri, fiecare ciclu constând în denaturare la 94 ° C timp de 10 secunde, recușire la 60 ° C timp de 30 secunde și extensii la 68 ° C timp de minim 5 minute, cu o extensie finală la 68 ° C. timp de 15 minute.

Screening mutațional

Rezultatul

În acest studiu, raportăm o analiză mutațională a genei GALT aparținând a 56 de pacienți, reprezentată de constatări clinice pentru galactozemie clasică și tip Duarte-1. Substituțiile nucleotidice din gena GALT au fost detectate folosind microarrays de secvență, cu excepția ștergerii sau inserării modificărilor nucleotidice. Mutațiile de inserție/ștergere au fost detectate folosind secvențierea directă a ADN-ului. Screeningul mutațional a identificat 109 din 112 alele mutante din gena GALT. Unsprezece tipuri de mutații au fost detectate la acești pacienți, inclusiv nouă mutații recurente (c.425T> C; M142K, c.536G> A; G179D, c.563A> G; Q188R, c.692G> A; R231H, c.855G > T, K285N, c.881T> A, F294Y, c.958G> A, A320T, c.983G> A a; R328H, c.940A> G; E340 *) și două mutații noi (c.772C> G; A); R258G și c.928delG; G310fsX49). Noua mutație G310fsX49 a fost detectată folosind secvențierea directă a ADN față de alte mutații.

Patruzeci și nouă de pacienți au fost homozigoți și patru pacienți au avut o mutație heterozigotă. Doar o alelă mutantă a fost identificată la trei pacienți. A fost atinsă o rată de detectare a mutației de 97,3%. Q188R sa dovedit a fi cea mai frecventă mutație în acest studiu, cu o frecvență de 55,35%. Q188R a fost detectat în alele la 29 de pacienți și la o alelă la patru pacienți. A320T (7, 14%), E340 * (10, 71%) și M142K (6,25%) au fost găsite ca a doua mutație cea mai frecventă. E340 * a fost detectat la șase pacienți homozigoti împreună cu variantele N314D și L218L (alela Duarte-1). S-a găsit o alelă Duarte-1 cu o frecvență de 10,71%. Alela Duarte-2 nu a fost detectată în acest studiu.

S-a constatat că alelele Duarte-1 și Duarte-2 sunt prezente la o frecvență de 2,3% și 1,4% în screeningul a 105 indivizi sănătoși din populația turcă. Toate mutațiile identificate și frecvențele lor de alelă sunt rezumate în Tabelul 1.

Tabel în dimensiune completă

discuţie

Acest studiu a fost efectuat pe screening-ul genetic și caracterizarea spectrului mutațiilor patogene ale genei GALT în 56 de cazuri de galactozemie (50 clasice și 6 tip Duarte-1). În plus, au fost determinate frecvențele alelelor Duarte-1 și Duarte-2 în populația turcească. Sondajele efectuate la diferite populații au arătat că incidența galactozemiei clasice este cuprinsă între 1: 30.000 și 60.000. 2, 3, 11 Cu toate acestea, galactozemia clasică a fost mai frecventă în Turcia, cu o incidență de 1:23 775. 12

Mai mult de 250 de mutații în diferite populații etnice au fost descrise în gena GALT la nivel mondial. Am găsit 11 mutații genetice diferite, dintre care două erau noi, inclusiv R258G și G310fsX49. Analize detaliate ale efectelor mutațiilor asupra activității enzimei și a structurii proteinelor sunt disponibile în publicațiile anterioare. 13, 14 Aici am discutat doar posibilele efecte ale noilor mutații asupra nivelului de proteine ​​descrise în acest studiu de screening genetic. Una dintre ele este o nouă mutație R258G, care a fost găsită în starea heterozigotă compusă cu Q188R. Este posibil ca reziduul R258 pe suprafața proteinei să fie implicat în formarea unei punți de sare, modificând astfel proprietățile de suprafață ale moleculei. Lanțul lateral al reziduului de glicină din mutația R258G este, de asemenea, foarte mic. Mutația poate afecta asamblarea dimerilor și stabilitatea sau stabilitatea monomerului. Mutația de schimbare a cadrului G310fsX49 duce la un codon de oprire la poziția 49 a aminoacizilor în spatele nucleotidei șterse.

Cea mai comună mutație Q188R din gena GALT a fost găsită la 55,35% din populația turcă în acest studiu. Rezultatele noastre de frecvență Q188R din acest studiu sunt compatibile cu studiile publicate anterior la pacienții cu galactozemie turcească, care au raportat frecvențe de 57% și 47%. 15, 16

Mutația Q188R este cea mai comună alelă în toate țările europene, iar frecvența acesteia variază considerabil în funcție de populație. Frecvența mutațiilor (între 45 și 93,6%) a fost raportată în următoarele țări în următoarele cazuri: Irlanda, 93,6%; 17 Regatul Unit, 77%; 3 Portugalia, 57,8%; 18 Olanda, 58,5%; 19 Spania, 50%; 18 Germania, 69%; 20 Austria, 60%; 21 Polonia, 51,3%; 22 Republica Cehă și Republica Slovacă, 46%; 7 și Ungaria, 45%. La fel ca în aceste țări europene, s-a constatat că este cea mai comună mutație cauzatoare de boli în populația turcă, iar datele prezentate întăresc modelul observat conform căruia frecvența mutației Q188R scade de la vest la est și nord. în sud pe continentul european. 24

În acest studiu al populației turcești, K285N este înregistrat la doar 3,57% din populație. Mutația K285N este a doua cea mai frecventă mutație în majoritatea țărilor europene. Frecvența acestei alele mutante variază de la 19 la 33,8% la diferite populații europene. 7, 20, 21, 22, 23 Spre deosebire de aceste frecvențe înalte observate și menționate mai sus, unele populații au o frecvență scăzută de alele pentru această mutație, cu o distribuție între 2, 4 și 9, 8% în țările europene. 18, 19, 25

Aceste trei alele mutante A320T (7, 14%), E340 * (10, 71%) și M142K (6,25%) sunt a doua în frecvență la pacienții turci și sunt observate mai frecvent decât la alte populații. A320T și M142K au fost descrise ca variante rare în alte studii. 26

Spectrul mutațiilor detectate până acum în GALT este după cum urmează: M142K, G179D, Q188R, L218L, R231H, R258G, K285N, F294Y, N314D, G310fsX49, A320T, R328H și E340 *; toate reprezintă marea majoritate a alelelor cauzatoare de boli din populația turcească pentru galactozemie din cauza defectelor genei GALT. Majoritatea variațiilor cauzatoare de boală în GALT au fost definite, iar rezultatele acestui studiu sunt compatibile cu rezultatele anterioare. 15, 16

Toate mutațiile din gena GALT sunt colectate în exonii 5, 6, 8, 9 și 10 ai genei. În ceea ce privește toate mutațiile detectate, exonii 6 și 10 reprezintă 79% din toate alelele mutante din populația noastră. O observație importantă este frecvența mai mare a mutațiilor localizate la acești exoni la pacienții cu galactozemie turci. Aceste descoperiri ar fi utile în studiile de diagnostic molecular pentru a clasifica alelele în termeni de prioritate pentru screeningul mutațional printre mutațiile patogene care cauzează galactozemie, al căror număr este în prezent mai mare de 250.

Interesant este că, așa cum am afirmat deja în literatură, am observat că opt pacienți cu mutație E340 * au fost de origine turcă și au purtat această mutație în cis cu N314D și L218L. Gathof și colab. 27 au raportat pentru prima dată un băiat turc cu E340 *, N314D și L218L. Schuster și colab. 28 au raportat doi frați turci și un alt studiu realizat de Seyrantepe și colab. 15 din Turcia au menționat un alt pacient turc cu același genotip; în studiul nostru am identificat șase pacienți care au avut mutația E340 * în cis cu N314D și L218L.

Haplotipul E340 *, N314D și L218L provin cel mai probabil de la strămoșii turcilor. În concluzie, ar trebui să identificăm originea mutației; cu toate acestea, nu este posibil să se demonstreze o abordare bazată pe dovezi a efectului fondator al haplotipului în populația turcă cu date disponibile în prezent de la un număr limitat de pacienți.

În acest studiu, am evaluat și prezența variantelor Duarte în populația turcească. Un total de 105 indivizi sănătoși (n: 210 alele) au fost selectați pentru prezența variantelor Duarte ale genei GALT și au fost detectate un total de 8 alele (3,8%) pentru N314D: cinci (2,3%) au fost identificate ca Duarte-1 Varianta și trei (1,4%) ca variantă Duarte-2. Frecvența alelei Duarte în Europa a arătat o diferență semnificativă în funcție de regiune. Distribuția frecvenței este următoarea: Europa de Nord, 7,9%; Europa de Est, 5, 3%; Europa de Vest, 6,1%; și sudul Europei, 2, 0%. Populațiile afro-americane și asiatice au o frecvență mai mică a alelei Duarte, respectiv 1,3% și 1,5%. Frecvența alelei Duarte în populația noastră este mai mică decât frecvența așteptată (% 3, 8) comparativ cu Europa de Est. Dacă mutația E340 * provine dintr-un strămoș comun, ar fi posibil ca acest strămoș să poarte și alela Duarte-1 și, prin urmare, majoritatea alelelor Duarte sunt împreună cu E340 *. Cu toate acestea, frecvența acestei alele la persoanele sănătoase este mai mică, deoarece nu poartă haplotipul care cauzează boala pentru E340 *. O altă posibilă explicație pentru diversitatea și diferențele de distribuție între alelele Duarte, în special între mutațiile comune ale genei GALT, poate fi locația geografică a Turciei, care traversează cele două continente, Asia și Europa.

O rată ridicată de detectare a mutației de 97,3% a fost atinsă prin aplicarea unui microarray de secvențiere a secvenței în acest studiu de screening al mutației. Această metodă oferă o abordare rapidă și rentabilă a screening-ului pentru mutații în bolile moștenite. Comparativ cu metodele de screening genetic clasice disponibile, restricția microarray poate fi considerată o metodă adecvată în ceea ce privește viteza, reproductibilitatea și aplicabilitatea pentru analiza a mii de nucleotide într-o singură platformă de câmp. Acest studiu este primul raport al utilizării sale în screening-ul genetic la pacienții cu galactozemie clasică.