obiecte
abstract
Subiecții obezi au niveluri ridicate de glucagon 1, 2 pe post, pe lângă concentrațiile crescute de insulină 1 circulante. Deși s-a acordat multă atenție nivelurilor crescute de insulină, care accelerează dezvoltarea diabetului zaharat de tip 2 (T2DM) 3, nivelurile ridicate de glucagon cu repaus alimentar au primit o atenție crescândă, la fel de importante pentru progresia bolii către T2DM 4. În condiții normale, o creștere a nivelului de glucoză are efecte opuse asupra secreției de insulină și glucagon din celulele beta și alfa, ceea ce este paradoxal la pacienții cu T2DM, când o creștere a nivelului de glucoză stimulează ambii hormoni 5. Nivelurile ridicate de glucagon declanșează producția hepatică de glucoză, ducând la o cerere mai mare de insulină, care poate accelera stresul celulelor beta și, astfel, poate contribui la dezvoltarea bolii6.
Secreția de glucagon și insulină în repaus alimentar ar putea fi reglată în continuare prin efecte paracrine, de ex. Efectele inhibitoare ale insulinei asupra celulelor alfa 20, 21, 22 și a somatostatinei asupra celulelor alfa și beta 23, 24. Pe baza acestor observații, o scădere a secreției de somatostatină ar putea contribui la o creștere atât a secreției de glucagon cât și a insulinei. Măsura în care o astfel de scădere a eliberării de somatostatină este observată în condiții de repaus alimentar atunci când crește secreția de glucagon și insulină este necunoscută.
Având în vedere situația la copiii obezi cu creșteri concomitente ale insulinei și glucagonului 1 și niveluri crescute ale FFA la nivelurile normale de glucoză în repaus 25, scopul nostru a fost să investigăm modul în care nivelurile cronice crescute ale FFA au afectat glucagonul, insulina și, de asemenea, secreția de somatostatină din insulele umane izolate în post. stat. concentrațiile de glucoză cu un accent special pe rolul FFAR1.
Rezultatul
Palmitatul crește insulina bazală de glucagon și secreția de insulină prin FFAR1
Efectul palmitatului asupra glucagonului acumulat (panoul A) și secreției de insulină (panoul B) din insulele umane izolate cultivate de 0,25 până la 7 zile la 5,6 mM glucoză în absența (simboluri albe) sau prezența (simboluri negre) a palmitatului cu și fără FFAR1 un antagonist ANT203. Conținutul celular de glucagon (panoul C) și insulină (panoul D) la sfârșitul culturii în insulele tratate cu palmitat cu și fără antagoniști FFAR1 ANT203 și ANT825 a fost prezentat ca% din conținutul de hormoni în insulele care au primit tratament de control. Nivelurile de ARNm FFAR1 (panoul E) și proteine (panoul F) în insulele tratate cu palmitat și fără antagonistul FFAR1 ANT203. Nivelurile de transcripție și proteine sunt exprimate ca% din nivelurile din insulele care au primit tratament de control. Rezultatele arată media ± SEM a n = 3-5 experimente din experimentele donatorilor. * P # p
Efectul reducerii expresiei FFAR1 asupra secreției hormonale acumulate din insulele umane cultivate la 5,6 mM glucoză în absență (bare albe) sau prezența palmitatului 0,5 mM (bare negre) timp de 1 zi. Niveluri relative de ARNm FFAR1 (panoul A) și proteina totală FFAR1 (panoul B) la sfârșitul culturii, comparativ cu ARNm țintă non-mamifer (neg) sau tratament cu ARNm vizat de shfar (Ffar1). Sunt prezentate secrețiile acumulate de glucagon (panoul C), insulină (panoul D) și somatostatină (panoul E). Rezultatele arată media ± SEM și provin din n = 3-5 experimente donatoare. * P # p
Efectul FFAR1 și beta-oxidarea acizilor grași asupra glucagonului bazal (panourile A, G), insulinei (panourile B, H) și a secreției de somatostatină (panourile C, I) și a conținutului (panourile DF, F). Insulele umane au fost cultivate timp de 1 zi cu sau fără agoniști FFAR1; TAK-875, GW9508, TUG-499 în comparație cu palmitatul (bare negre) (panoul A - C) și palmitatul cu și fără ANT825 și/sau etomoxir (panoul G - I). Rezultatele arată media ± SEM și provin din n = 5 experimente donatoare. # P 16, 26. Când rezultatele acestui studiu au arătat că secreția hormonală a insulelor afectată de palmitat prin FFAR1 la concentrațiile bazale de glucoză, am emis ipoteza că acidul gras poate afecta și respirația la concentrațiile de glucoză în repaus alimentar. De fapt, respirația mitocondrială a fost redusă fie prin adăugarea acută de ANT203 la insulele expuse la glucoză și palmitat de 5,6 mM (Fig. 4A, B), fie prin includerea unui antagonist structural diferit ANT825 în timpul culturii insulelor în prezența glucozei 5,6 mM și palmitat (Fig. 4C, D). Scăderea respirației mitocondriale ANT825 în prezența palmitatului sa datorat în mare parte scăderii respirației asociate cu ATP (Fig. 4E).
Rolul FFAR1 și al beta-oxidării acizilor grași în efectul palmitatului asupra secreției și respirației insulinei EndoC-pH1. Celulele au fost expuse la glucoză 5,6 mM în absența (simboluri albe) sau prezența (simboluri negre) a palmitatului cu ANT825 și/sau etomoxir, trimetazidină și fără acesta. Secreția de insulină (panoul A). Înregistrări OCR cinetice reprezentative de la celule expuse acut la palmitat cu ANT825 și/sau etomoxir (panoul B). OCR mitocondrial (panoul C), OCR legat de ATP (panoul D) și OCR cu scurgere de protoni (panoul E). Rezultatele arată media ± SEM (panourile A, CE,) (n = 5) și media ± SD (panoul B) (N = 6). * P # P & P 1, 2. În acest studiu, oferim dovezi că o astfel de îmbunătățire hormonală a insulelor duale poate fi rezultatul creșterii concentrațiilor de FFA circulante, care este caracteristic acestui grup de pacienți 25. Astfel, nivelurile de glucagon și insulină în repaus alimentar se pot datora unei combinații de activare FFAR1 și metabolismul celulelor insulelor și nu doar pentru a compensa rezistența la insulină. Înțelegerea mecanismelor prin care FFA provoacă o secreție bazală sporită a hormonilor insulelor este crucială pentru oprirea acestui cerc vicios.
Rezultatele acestui studiu sunt derivate din experimente in vitro și nu pot fi transferate direct într-un cadru in vivo cu complexitate incluzând, de exemplu, incretine, activitate neuronală și diverse FFA care modulează secreția de insulină și glucagon. Cu toate acestea, rezultatele arată mecanismul prin care creșterea FFA circulantă și a trigliceridelor poate duce la o creștere concomitentă a tonusului bazic de secreție de glucagon și la secreția de insulină în repaus alimentar, care poate afecta controlul glucozei într-o situație cronică.
Pentru a rezuma, concluzionăm că FFA sunt regulatori nu numai de insulină, ci și de secreție de glucagon și somatostatină la concentrațiile de glucoză în repaus alimentar din insulele umane și că FFAR1 este crucial în acest sens. Adică, efectul FFAR1 asupra secreției hormonale nu se limitează la amplificare la concentrații crescute de glucoză, așa cum s-a discutat anterior, ci mai degrabă dependent de substratul combustibilului. Prin urmare, sugerăm că liganzii endogeni FFAR1 pot spori eliberarea insulinei și glucagonului la concentrații de glucoză în repaus alimentar prin rolul lor dublu de activatori ai receptorilor și metaboliților combustibili.
Materiale și metode
Insulele pancreatice umane
Insulele umane au fost obținute de la indivizi morți, în caz contrar, sănătoși, fără boli metabolice cunoscute, de la Unitatea de Transplant de Insule ale Universității Uppsala și Prodo Lab Inc. (Irvine, CA, SUA). Aprobarea etică pentru utilizare și procedurile și protocoalele pentru manipularea insulelor izolate de indivizi au fost obținute de la Comitetul regional de evaluare a eticii din Uppsala, Suedia (numărul EPN 2010/006; 2010-02-10). Toate procedurile care implică insulițe au fost efectuate în conformitate cu aprobarea de mai sus, precum și în conformitate cu directivele și reglementările locale aplicabile. Consimțământul informat în scris al tuturor donatorilor a fost furnizat de donatori individuali sau de membrii familiei acestora și documentat. Obținerea și documentarea consimțământului scris pentru donarea insulelor pentru cercetare a fost efectuată în conformitate cu aprobarea menționată mai sus a Comitetului regional de revizuire a eticii din Uppsala, Suedia, precum și în conformitate cu reglementările și orientările locale aplicabile. În total, au fost utilizate insule de la 19 donatori non-diabetici. Insulele au fost cultivate în mediu CMRL 1066 conținând 5,6 mM glucoză și suplimentate cu FBS 10% (Invitrogen, Paisley, Marea Britanie), denumite în continuare condiții de control. Experimentele au fost începute la 3 - 7 zile după izolare.
Celule EndoC-pH1
Celulele EndoC-pH1 27 au fost crescute pe un gel matricial extracelular 1% și 2 μg/ml vase de cultură acoperite cu fibronectină în DMEM conținând 5,6 mM glucoză, fracție 2% albină serică albumină serică albină (BSA) (Roche Diagnostics, Mannheim, Germania).). ), 10 mM nicotinamidă, 50 μM 2-mercaptoetanol, 5,5 μg/ml transferrin, 6,7 ng/ml selenit de sodiu, 100 U/ml penicilină și 100 μg/ml streptomicină. Dacă nu se specifică altfel, toate substanțele chimice au fost obținute de la Sigma Aldrich.
Tratamentul insulelor și celulelor EndoC-pH1 cu palmitat de acid gras cu lanț lung
Măsurarea secreției hormonale și a conținutului
Concentrațiile de glucagon, insulină (Mercodia AB, Uppsala Suedia) și somatostatină (Peninsula Laboratories, San Carlos, CA, SUA) în mediul de cultură și în probele de lizat celular au fost măsurate prin ELISA. Conținutul de hormoni a fost normalizat la conținutul total de proteine, măsurat prin testul proteinei DC (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, SUA) și apoi prezentat ca un multiplu al tratamentului de control.
Reglarea descendentă a FARN FFAR1
ARN scurt de ac de păr (rezumat) din FFAR1 a fost utilizat pentru a inhiba expresia FFAR1 și a fost administrat cu transferul de particule lentivirale SHCLNV VSV-G (misiunea de transducție a particulelor, Sigma Aldrich), care conține o direcționare sumară a Ffar1/Gpr40 cu secvența CCGGCGCCTCGGTTGTGTGTGTGT Aproximativ 50 de insule au fost transduse în fiecare godeu (placă cu 96 de godeuri fără cultură de țesut) cu 2-5 x 106 TU particule transductoare în 50 μl dintr-un amestec 1: 1 de DMEM amestecat cu mediu de cultură CMRL (fără FBS fără BSA) pentru 2 ore așa cum a fost descris mai sus. Apoi s-au adăugat încă 150 pl de mediu de cultură și amestecul a fost lăsat să se incubeze timp de 22 de ore. Ulterior, mediul a fost înlocuit cu 200 μL de mediu CMRL. Pe baza tratamentului estimat pentru rotirea receptorilor, la 3 zile după începerea transfecției și probele prelevate la 2 zile după începerea tratamentului cu palmitat au fost începute.
Măsurarea nivelului de ARNm FFAR1 prin PCR în timp real
ARNm total a fost izolat din celulele insulelor folosind ARN-ul NucleoSpin® (Macherey-Nagel, Duren, Germania) și transcris invers în ADNc folosind sistemul de sinteză SuperScript-III First Strand pentru RT-qPCR (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA). PCR în timp real a fost efectuat într-un volum de 10 μl utilizând kitul Dynamic Capillary SYBR Green qPCR (Thermo Scientific, Waltham, MA, SUA). Pentru amplificare s-au folosit următoarele grunduri: FFAR1 (grundul înainte, 5'-ATCACAGCCTTCTGCTAC și grundul invers, 5'-CCTAGATTGGGGTACAGG), β-actina (grundul înainte, 5'-ACGTGGACATCCGCAAAGAC) și (grundul invers, 5T-CCTTGCT CCT-CCT-CCT-CCT Nivelul ARNm FFAR1 a fost normalizat la gena de referință a β-actinei utilizând următoarea formulă: cantitate țintă = 2-AACt, unde AACt = [Ct (GPR40 KO) - Ct (β-actină KO)] - [Ct (control GPR40) - Ct (controlul β-actinei)] 55 .
Măsurarea nivelului de proteină FFAR1 de către ELISA
Aproximativ 100-500 de insule umane izolate au fost recoltate după cultivare și spălate de trei ori cu PBS rece ca gheața. Celulele au fost lizate în 100 μl de 1% TritonX-100 (Sigma-Aldrich) în PBS. Lizatele au suferit cinci cicluri de înghețare și dezghețare rapidă pentru a crește cantitatea de proteine legate de membrană. FFAR1 total în probele de lizat a fost măsurat de către un om comercial FFAR1/GPR40 Sandwich ELISA (LS-F8454, LifeSpan BioSciences, WA, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Celulele HEK293 au fost utilizate ca martor negativ și au prezentat o reactivitate scăzută ca răspuns în comparație cu celulele EndoC-pH1 (vezi figura suplimentară SI).
Respirație celulară
Respirația mitocondrială a insulelor umane izolate și a celulelor EndoC-pH1 a fost determinată prin măsurători OCR într-un analizor de flux extracelular XF96e (Agilent Technologies). Testele au fost efectuate în mediu minim de testare XF (Agilent Technologies) ajustat la pH 7,4 și suplimentat cu glucoză 5,6 mM. Ambele insule (10-30 pe godeu și 10 godeuri pentru fiecare afecțiune (N = 10)) și celulele EndoC-pH1 au fost plasate într-un godeu cu 96 de godeuri (60.000 de celule per godeu și cel puțin 6 godeuri pentru fiecare afecțiune (N = 6) ).)) plăci de cultură pre-acoperite (vezi mai sus). Funcția mitocondrială a fost determinată prin măsurarea respirației bazale, respirația asociată cu ATP, evacuarea protonilor, capacitatea respiratorie maximă prin adăugarea de inhibitori ai oligomicinei lanțului de transport al electronilor (2 μM), rotenonă (5 μM) și antimicină (5 μM), precum și ionofor. FCCP (2 μM) descris mai sus 16. OCR bazal a fost măsurat după 2 ore de cultură. Toate măsurătorile OCR au fost corectate pentru OCR non-mitocondrial. Dacă nu se specifică altfel, toate substanțele chimice au fost obținute de la Sigma Aldrich.
analize statistice
Analiza a fost efectuată utilizând software-ul Graph Pad Prism, versiunea 6 (San Diego, CA, SUA). Testele t asociate și măsurile repetate ANOVA unidirecționale (cu testul Fishers LSD post-hoc) au fost utilizate pentru analiza statistică. P