obiecte

abstract

Kappa glutation transferaza (GSTK1-1), denumită și proteina oxidoreductază asemănătoare legăturii sulfurice (DsbA-L), este implicată în multimerizarea post-translațională a adiponectinei și a fost corelată negativ cu obezitatea la șoareci și oameni. Am examinat adiponectina la șoareci Gstk1 -/- și în mod surprinzător nu am găsit diferențe între nivelurile totale de adiponectină serică sau nivelurile multimerice cu greutate moleculară mare (HMW) comparativ cu martorii normali. Electroforeza pe gel SDS-poliacrilamidă nereducătoare și Western blot au arătat, de asemenea, o distribuție similară a multimerilor mici, medii și HMW la șoareci normali și Gstkl -/-. Variația adiponectinei s-a corelat cu toleranța la glucoză și nivelurile de AMP-kinază fosforilată, dar am găsit o toleranță similară la glucoză și niveluri similare de protein kinază activată cu fosfo-5-AMP la șoareci normali și Gstkl -/-. În consecință, constatările noastre sugerează că GSTK1-1 nu este absolut necesar pentru multimerizarea adiponectinei in vivo și, în absența GSTK1-1, pot fi activate căi alternative.

kappa

Adiponectina este o adipokină secretată în principal de țesutul adipos alb care are diferite roluri în reglarea metabolismului glucozei și a acizilor grași prin inducerea oxidării acizilor grași, suprimarea gluconeogenezei hepatice și creșterea sensibilității ficatului și a mușchilor la insulină. Nivelurile scăzute de adiponectină circulantă sunt asociate cu obezitatea și rezistența la insulină, 2, 3 și nivelurile ridicate se corelează cu protecția împotriva patologiilor legate de obezitate, inclusiv diabetul de tip 2 și sindromul metabolic, hipertensiunea arterială 4, ateroscleroza 6 și boala hepatică grasă nealcoolică. 7 Adiponectina circulă în sânge ca cele trei forme oligomerice majore legate de disulfură; trimer cu greutate moleculară mică, hexamer cu greutate moleculară medie și multimeri 12-18 cu greutate moleculară mare. Există dovezi substanțiale că diferiți oligomeri au funcții biologice diferite. 1, 8

Un studiu recent efectuat pe 3T3-L1, 9 celule a raportat că oligomerizarea adiponectinei a fost promovată de glutation transferază (GSTK1-1) kappa și că eliminarea GSTK1-1 a redus semnificativ nivelurile secretate de adiponectină HMW în adipocitele 3T3-L1. GSTK1-1 este exprimat într-o varietate de țesuturi, inclusiv țesutul adipos alb, o sursă majoră de adiponectină in vivo. Expresia 9, 10, 11 GSTK1-1 a fost, de asemenea, corelată negativ cu obezitatea la șoareci și oameni și, prin urmare, a fost propusă ca o nouă țintă pentru dezvoltarea medicamentelor pentru tratamentul rezistenței la insulină și a tulburărilor metabolice conexe. 9

Deși GSTK1-1 are activități de glutation transferază ca GST citosolice, este localizată în mitocondrii și peroxizomi 12 și structura sa diferă semnificativ de cea a GST-urilor citosolice și microsomale. GST-urile Kappa prezintă un fel similar cu proteinele bacteriene care formează legături disulfură, cum ar fi oxidoreductaza A (DsbA) legată de disulfură. 11, 13, 14 Similitudinea structurală a GSTK1-1 cu DsbA a condus la opinia că ar trebui redenumită DsbA-Like (DsbA-L); Cu toate acestea, este similar cu izomerazele bacteriene ale 2-hidroxicromenei-2-carboxilatului. Deși am arătat că GSTK1-1 are activitate semnificativă de glutation transferază in vitro, 13 am dezvoltat șoareci knockout GstK1 pentru a investiga rolul său biologic in vivo. Am observat că deficitul de GSTK1-1 cauzează nefropatie glomerulară, inclusiv modificări ale membranei bazale, procesul podocitelor și microalbuminuria. Interesant este că acest fenotip este similar cu cel găsit la șoarecii cu deficit de adiponectină, care prezintă albuminurie și fuziune a proceselor podocite. 16

Având în vedere rolul aparent al GSTK1-1 în oligomerizarea adiponectinei și asemănarea în GSTK1-1 și fenotipurile de șoarece cu deficit de adiponectină, am investigat acum efectul deficienței GSTK1-1 asupra funcțiilor multimerizării adiponectinei și a adiponectinei la șoareci GstK1 -/-.

Materiale și metode

A fost descrisă generația de șoareci GstK1 -/- utilizată în acest studiu. Cincisprezece șoareci masculi GstK1 -/- și controlul lor de tip sălbatic la vârsta de 12 până la 20 de săptămâni au fost folosiți în acest studiu. O dietă bogată în grăsimi (Specialty Feeds, Glen Forrest, WA, Australia) a fost administrată ad libitum timp de 8 săptămâni și a constat din 23% grăsimi, 0,19% colesterol cu ​​43% energie digestibilă totală derivată din lipide.

Teste de toleranță la glucoză

Șoarecii au fost posti timp de 6 ore înainte de determinarea glicemiei folosind un glucometru Optium Xceed (Abbot Diagnostics, VIC, Australia). Șoarecii au fost apoi injectați intraperitoneal cu 2 g/kg D-glucoză (Sigma Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia) și glicemia a fost măsurată la fiecare 15 minute timp de 1 oră.

Imunoanalize adiponectinice specifice HMW și specifice HMW (ELISA)

Nivelurile totale de adiponectină serică (sisteme R și D, Minneapolis, MN, SUA) și specifice HMW (Alpco Diagnostics, Salem, NH, SUA) au fost măsurate folosind kituri ELISA comerciale conform instrucțiunilor furnizorului.

Western blot

Pentru adiponectina serică, o diluție de 2,5 μl a unui ser de șoarece de 1: 1500 a fost împărțită într-o singură bandă pe un gel de poliacrilamidă SDS 4-20% care nu reduce, denaturând (Biorad, Hercules, CA, SUA). Pentru proteina kinaza fosfo-5-AMP total activată (AMPK), ficatul a fost omogenizat în tampon T-PER (Thermo Scientific, Rockford, IL, SUA) suplimentat cu protează (Roche, Castle Hill, NSW, Australia) și inhibitori ai fosfatazei ( Merck, Darmstadt)., Germania). Proteinele au fost cuantificate folosind un kit de testare a proteinelor BCA (Thermo Scientific) și 20 μg de proteine ​​împărțite pe bandă. Gelurile au fost șterse pe membranele Immobilon PVDF (Millipore, Billerica, MA, SUA) și blocate peste noapte la 4 ° C în 2% BSA în soluție salină tamponată Tris (100 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20, pH 7,5) Membranele au fost testați cu anticorpi anti-adiponectină (Millipore), anti-total sau anti-fosfo Thr172-AMPK (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, SUA). Membranele au fost sondate cu anticorpi secundari conjugați cu HRP (Dako, Produktionsvej, Danemarca), dezvoltate folosind reactivi chemiluminescenți amplificați (GE Healthcare Bio-Sciences, Rydalmere, NSW, Australia) și expuse la film cu raze X.

Rezultatul

Am utilizat inițial un Western blot pentru a confirma că GSTK1-1 a fost exprimat în țesutul alb adipos al șoarecilor normali și nu este prezent la șoarecii Gstkl -/- (Figura 1a).

( A ) Western blot anti-GSTK1 pe țesut adipos alb gonadal la șoareci GSTK1 +/+ și GSTK1-/-. ( b ) Adiponectina serică totală măsurată prin ELISA la șoarecii GSTK1 +/+ și GSTK1 -/- hrăniți cu o dietă normală. N = 15 pentru ambele grupuri. ( c ) Ser de adiponectină HMW măsurat prin ELISA la șoareci GSTK1 +/+ și GSTK1 -/- hrăniți fie cu chow normal, fie cu o dietă bogată în grăsimi. N = 5 pentru toate grupurile. ( d ) Detectarea multimerului seric al adiponectinei prin electroforeză nereducătoare gel SDS-poliacrilamidă urmată de Western blot la șoareci GSTK1 +/+ și GSTK1-/-. ( e, f ) Test de toleranță intraperitoneală la glucoză la șoareci GSTK1 +/+ și GSTK1 -/- hrăniți fie cu chow normal ( e ) sau o dietă bogată în grăsimi ( f ). N = 6 pentru toate grupurile. ( g ) Niveluri hepatice de fosfo- și niveluri totale de AMPK detectate de Western blot. Pentru toate bloturile, este prezentată o pereche reprezentativă a uneia dintre cele patru perechi de șoarece și vârstă și sex GSTK1 +/+/GSTK1-/-.

Imagine la dimensiune completă

Pentru a examina distribuția mărimii adiponectinei în ser, am folosit electroforeză nediductivă pe gel SDS-poliacrilamidă pentru a fracționa serul de la șoareci cu conținut ridicat de grăsimi hrăniți timp de 8 săptămâni și a caracteriza multimerii adiponectinei prin Western blots. Am găsit o distribuție similară a greutății moleculare mici, a greutății moleculare medii și a multimerilor HMW atât la șoareci de tip sălbatic, cât și la șoareci GstK1 -/- (Figura 1d).

Deoarece nivelurile de adiponectină s-au corelat cu o toleranță îmbunătățită la glucoză, am supus șoarecilor de tip sălbatic și GstK1 -/- hrăniți fie cu o dietă normală (Figura 1e), fie cu o dietă bogată în grăsimi (Figura 1f) la un test de toleranță intraperitoneală la glucoză. Nu s-au observat diferențe în concentrațiile de glicemie în jeun sau clearance-ul glicemiei între șoarecii de tip sălbatic și GstK1-/-.

Adiponectina are efecte benefice asupra sensibilității la insulină prin fosforilare și activarea AMPK. Cu toate acestea, în studiul nostru, nu s-au găsit diferențe în nivelurile de fosfo-AMPK hepatic între șoarecii de tip sălbatic și șoarecii GstK1 -/- hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi (Figura 1g).

discuţie

Adiponectina este foarte interesantă datorită rolului său critic în menținerea sensibilității la insulină și a efectelor sale antiinflamatoare. Multimerizarea post-translațională a adiponectinei la specii cu greutate moleculară mică, greutate moleculară medie și HMW este de o importanță deosebită, deoarece efectele metabolice benefice ale adiponectinei sunt în mare parte atribuite formei HMW. Deoarece GSTK1-1 este implicat în oligomerizarea post-translațională a adiponectinei și expresia acesteia în țesutul adipos a fost corelată negativ cu sindromul metabolic la șoareci și oameni, 9 au emis ipoteza că șoarecii cu deficit de GSTK1-1 pot suferi de o deficiență majoră a oligomerilor de adiponectină și au un fenotip care reflectă anomalii ale sensibilității la insulină. Într-un studiu anterior, am constatat că șoarecii GstK1 -/- au avut niveluri serice de adiponectină ușor mai mici (P = 0,047), dar această diferență nu a fost prezentă în studiul actual cu un număr mai mare de șoareci. În mod surprinzător, studiile prezente nu au evidențiat o modificare a adiponectinei serice totale sau HMW sau a modelului de multimerizare. În plus, nu am găsit nicio dovadă a scăderii toleranței la glucoză sau a nivelurilor de fosfo-AMPK, fenotipuri care ar putea fi prezise dacă șoarecii Gstk1 -/- ar prezenta un deficit semnificativ de adiponectină HMW.

Mai multe proteine, inclusiv proteina asociată cu reticulul endoplasmatic 44 (ERp44) și proteina asemănătoare oxidoreductinei-1 (Ero1-Lα), au fost implicate în multimerizarea, transferul și secreția adiponectinei (pentru o revizuire, vezi Wang și colab. 1) . Este posibil ca aceste sau alte proteine ​​chaperonice moleculare să promoveze, de asemenea, multimerizarea adiponectinei legate de disulfură și să ofere căi compensatorii alternative pentru oligomerizare în absența GSTK1-1.

Asemănările în patologia renală (albuminurie și anomalii ale procesului de podocite) observate la șoareci GSTK1-1-15 și 16 șoareci cu deficit de adiponectină sunt curioase, având în vedere că deficitul de deficit de GSTK1-1 se datorează multimerizării adiponectinei. Cu toate acestea, deoarece unele funcții de adiponectină par a fi specifice pentru oligomeri și întrucât distribuția dimensiunii oligomerilor în categoriile de greutate moleculară medie și HMW este largă (a se vedea Figura 1d), este posibil ca GSTK1-1 să fie responsabil pentru formarea unui subset specific de oligomeri care nu se disting prin metode.pe care le-am folosit în acest studiu.

Aceste date sugerează că orice încercare de reglare farmacologică a chaperonelor moleculare care contribuie la multimerizarea adiponectinei nu poate duce la o creștere netă a adiponectinei HMW. Prin urmare, lipsa efectului deficitului de GSTK1-1 asupra multimerizării adiponectinei raportată în acest studiu are un impact negativ asupra sugestiei că GSTK1-1 este o țintă pentru intervenția terapeutică în rezistența la insulină și tulburările conexe. 9