abstract

Principalul

Majoritatea studiilor publicate au analizat doar una sau două gene sau produse genetice în steatoza hepatică sau NASH și, prin urmare, nu au demonstrat diversitatea moleculară potențială a acestei caracteristici histologice frecvent observate a ficatului. Progresele recente în tehnologia microarray și bioinformatica au arătat eterogenitatea moleculară bazată pe profilurile de expresie genică din genom. Datele microarray publicate recent au arătat diferențe semnificative în expresia genelor importante pentru menținerea funcției mitocondriale între pacienții cu NASH și persoanele sănătoase. 13 Aici, am comparat nivelurile de ARNm la genomii ficatului normal și la ficatul gras fără semne histologice de inflamație pentru a ne îmbunătăți înțelegerea fiziopatogeniei steatozei în sine. .

Materiale și metode

Probe pentru pacienți și țesuturi

Tabel în dimensiune completă

Analiza histologică a biopsiilor hepatice umane a fost efectuată de doi patologi independenți. Gradul de steatoză a fost definit ca 1 când mai puțin de 30% din hepatocite au prezentat vacuole lipidice și 2 când 30-60% dintre hepatocite au prezentat vacuole lipidice. Au fost luate în considerare două grupuri de biopsii hepatice: primul grup a constat din nouă biopsii hepatice fără dovezi histologice de steatoză sau inflamație; al doilea grup a constat din nouă biopsii hepatice cu steatoză 1 (n = 5) și gradul 2 (n = 4). Niciunul dintre ficați folosiți nu a prezentat fibroză, corpusculi sau ciroză. IMC mediu a fost de 26,5 ± 4,3 kg/m2 în grupul de steatoză și 22,7 ± 3,0 kg/m2 la pacienții fără steatoză (P 16, 17, 18). Această procedură ține seama de distribuția comună a statisticilor de testare și folosește eșantionarea ( ex. Bootstrap sau permutare) pentru a estima această distribuție.

Analiza datelor a fost efectuată utilizând software-ul open-source R, versiunea 1.9.0. (CRAN, www.cran.r-project.org). Funcția hclust din pachetul de statistici a fost utilizată pentru clusterizarea ierarhică. Au fost utilizate următoarele pachete de proiecte Bioconductor (www.bioconductor.org 19): affy 20 pentru preprocesarea datelor, multtest 21 pentru identificarea secvențelor exprimate diferențial și anafie pentru adnotarea genelor.

RT-PCR cantitativ

Tabel în dimensiune completă

Cuantificarea MtDNA

Am cuantificat ADN mitocondrial (ADNmt) în ADN total extras din fiecare biopsie hepatică cu (n = 20) și fără (n = 20) steatoză folosind metoda descrisă mai sus. Pe scurt, gena nucleară (TaqMan® β-actin reactant, Perkin Elmer, Courtaboeuf, Franța) și gena mitocondrială MT-CYB (citocrom b sau cit b) au fost cuantificate separat prin PCR cantitativă în timp real. Am amplificat o porțiune din citochia genei mitocondriale cu primeri specifici (Tabelul 2). Amestecurile PCR conțineau 7 μl de apă, 12,5 μl de reactivi qPCR Mastermix Plus® (Eurogentec, Angers, Franța), 0,4 pmol/μl din fiecare primer și 0,2 pmol/μl din fiecare sondă. Fiecare probă a fost supusă PCR în timp real în triplicat. Condițiile de amplificare sunt aceleași ca cele descrise mai sus. Fluorescența a fost măsurată la sfârșitul fiecărei etape de recoacere. O curbă standard de 10, 100, 1000, 10.000 și 100.000 echivalenți ai genomului nuclear a fost inclusă în fiecare ciclu și aceleași valori echivalente ale genomului nuclear au fost utilizate pentru a cuantifica genele β-actină și cit b. Datele au fost exprimate ca raportul dintre valoarea medie a ADN-ului mitocondrial (cit b) al măsurătorilor triplicate la valoarea medie a ADN-ului nuclear (β-actină) a măsurătorilor triplicate pentru un anumit extract (mtDNA/β-actină).

imunohistochimie

Un total de 34 de țesuturi hepatice fixate în formalină au fost obținute din seturile noastre de patologii chirurgicale, care au fost identificate folosind o bază de date computerizată pentru a efectua analize imunohistochimice. Au existat 11 probe de ficat cu steatoză, 11 probe de ficat fără steatoză, patru hepatici infectați cu VHC care prezintă steatoză și opt probe de steatohepatită datorită consumului excesiv de alcool (n = 4) sau obezității (n = 4). Construcția microarray de țesut a fost preparată așa cum este descris în Kononen și colab. Fiecare caz conținea un triplet de țesut hepatic sub formă de pete cu diametrul de 0,6 mm. Imunomarcarea a fost efectuată utilizând tehnica standard avidin-biotină peroxidază cu colectarea antigenului în conformitate cu anticorpul studiat. Anticorpii principali utilizați au fost anticorpi monoclonali împotriva antigenului mitocondrial (diluție 1:50, clonă 113-1; Biogenex, San Ramon, CA, SUA), anticorpi policlonali anti-TGFB1 (sc-82) (diluție 1: 100, Santa Cruz, CA)., CA, SUA), anti-IL1-R1 (diluție 1: 400; AB-269-NA, R&D System, Lille, Franța) și anti-IGF2 (diluție 1: 800; AF-292-NA, R&D System, Lille, Franța). Diaminobenzidina a fost utilizată ca cromogen și hematoxilina ca agent de contrast nuclear. Pentru martorii negativi, anticorpul primar a fost omis sau înlocuit cu o concentrație adecvată de IgG normal din aceeași specie. Analiza a fost, de asemenea, descriptivă și semicantitativă, luând în considerare localizarea celulară a semnalului, în plus față de procentul de celule pozitive cu un scor de 0 (fără colorare), 1 (mai puțin de 25% din celule), 2 (între 25 și 75% din celule). ) și 3 (mai mult de 75%). Intensitatea imunocolorării a fost, de asemenea, evaluată cu 1 (slabă), 2 (medie) și 3 (puternică). Analiza celor trei nuclei pe probă a fost similară și a arătat un grad uniform de colorare între toți nucleii pentru toți anticorpii, cu excepția anticorpului monoclonal împotriva antigenului mitocondrial; s-a determinat un scor mediu. Toate secțiunile au fost evaluate independent de doi patologi.

analize statistice

Media și deviația standard au fost calculate în grupul hepatic negras și în grupul hepatic gras, iar rezultatele au fost comparate cu testul t Student (a = 0,05). Rezultatele imunochimiei au fost comparate cu testul χ 2 (α = 0,05).

Rezultatul

Expresia genelor

Am selectat biopsii hepatice pe baza prezenței sau absenței steatozei hepatice și a lipsei semnelor microscopice de inflamație. Niciuna dintre probe nu a prezentat semne de fibroză, corpuri sau ciroză. ARN a fost obținut din 18 biopsii de ficat uman (nouă și nouă fără steatoză hepatică); cele două grupuri nu au diferit, cu excepția faptului că IMC a fost semnificativ mai mare în grupul de pacienți cu steatoză hepatică.

ARN-ul fiecărei biopsii hepatice a fost hibridizat cu Affymetrix HG-U133A GeneChips care conțin aproximativ 22.300 de transcrieri umane. Dendrograma obținută prin aglomerarea grupării ierarhice a probelor de ficat fără selecția genelor este prezentată în Figura 1. Nouă probe de ficat steatotic au fost grupate, în timp ce nouă probe de ficat normale au profiluri de expresie genică mai eterogene.

investigarea

Agregarea ierarhică a probelor de ficat normale și steatotice. Gruparea ierarhică de aglomerare a fost efectuată fără preselecție genetică, folosind distanța euclidiană ca măsură a diferenței dintre eșantioane și asocierea medie ca măsură a diferenței dintre două clustere. "N" înseamnă probă normală de ficat și "S" înseamnă probă de ficat steatotică.

Imagine la dimensiune completă

În concordanță cu procedurile de testare a erorilor familiale maxT cu descărcare multiplă (eroare înțeleaptă eroare înțeleaptă 5%, adică 5% probabilitate de a avea cel puțin o eroare de tip I), 110 secvențe s-au dovedit a fi exprimate diferențial în probe de ficat normale și steatotice . Dintre acestea, 100 de secvențe au fost supraexprimate și 10 au fost subexprimate în probe de ficat steatotice. Listele de secvențe supraexprimate și subexprimate sunt date în Tabelul 3. Figura 2 prezintă profilurile de expresie ale acestor 110 secvențe în 18 probe de ficat.

Tabel în dimensiune completă

Profiluri de expresie a 110 secvențe exprimate diferențial (FWER = 0,05) în nouă probe de ficat normale și nouă steatotice. Fiecare rând reprezintă secvența sondei și fiecare coloană reprezintă o probă de ficat. Măsurile de expresie sunt standardizate pentru fiecare secvență de sondă (de exemplu, rânduri standardizate). Paleta de la verde la roșu este utilizată pentru a exprima nivelurile de expresie, cu verde reprezentând subexpresia și roșu reprezentând supraexpresia. Denumirile genelor sunt enumerate în Tabelul 2. "N" înseamnă probă normală de ficat și "S" înseamnă probă steatotică de ficat.

Imagine la dimensiune completă

Genele au fost clasificate în nouă familii în funcție de funcția lor (Tabelul 3). Una dintre aceste familii a inclus gene care codifică proteinele lanțului respirator mitocondrial și enzimele implicate în metabolismul lipidelor și sinteza creatinei. O altă familie a inclus gene care codifică transportorii de ioni, transportorii de lipide (apolipoproteina C-IV implicată în producția de lipoproteine ​​cu densitate foarte mică, în timp ce apolipoproteina E și receptorul de tip 1 scavenger B sunt implicate în captarea selectivă a colesterolului). Cele mai multe gene exprimate diferențial au aparținut unei familii de factori de transcripție (factori de transcripție nucleară și mitocondrială) sau proteine ​​codificate implicate în controlul ciclului celular (transducția semnalului, apoptoza și ciclul celular), modificări ale proteinelor și remodelarea matricei extracelulare. Două grupuri de gene au fost implicate fie în căile de reparare a deteriorării ADN-ului, fie în căile inflamatorii; acestea sunt TOLLIP, singura moleculă IL-1R legată de Ig (SIGIRR) și TGFB1 .

Conținutul mitocondriilor și ADN-ului mitocondrial la ficatul normal și gras

PCR cantitativă în timp real a fost utilizată pentru a determina raportul dintre ADNmt și ADN în 40 de biopsii hepatice, incluzând 18 biopsii ale studiului de profilare a genei și 22 de probe suplimentare. Raporturile medii de ADNmt la conținutul de ADN au fost de 0,67 ± 0, 10 și 1, 12 ± 0, 14 în grupul de biopsii hepatice fără și cu steatoză (P = 0,011, Tabelul 4). Acest rezultat a fost susținut de imunocolorarea mitocondriilor utilizând analiza microarraysului tisular (Figura 3). Într-adevăr, a fost observată o creștere a numărului de mitocondrii în hepatocitele cu picături grase (steatoza macrovesiculară) folosind colorarea profundă și numărând numărul de pete maronii (Figura 3c și d). În ficatul normal, colorantul s-a răspândit în țesutul hepatic (Figura 3a și b). Evaluarea semicantitativă a colorării a arătat o diferență semnificativă între cele două grupuri (două eșantioane pozitive din 11 ficați normali versus nouă eșantioane pozitive din 11 ficați grași; χ 2; P

Exemple de imunocolorare a mitocondriilor (maro) cu un anticorp anti-mitocondrial specific în ficatul normal ( A, b ) și în ficatul steatos macrovesicular ( c, d ) dintr-un microcip tisular. Miezul a fost colorat cu hematoxilină (albastru). A ) Imunomarcarea se răspândește în țesutul hepatic normal (× 20) părăsind vena portă. ( b ) (× 40) reprezintă mărirea pătratului din punctul ( A ) și prezintă pata distribuită în hepatocite. c ) Imunomarcarea se concentrează pe steatoza țesutului hepatic (× 20). ( d ) (x 40) reprezintă mărirea pătratului de la ( c ) și prezintă un loc îndreptat în jurul nucleului și vacuolei cu o intensitate puternică de colorare.

Imagine la dimensiune completă

Validarea expresiei genelor legate de stearoză în alte probe de ficat

Folosind procedura TaqMan®, am cuantificat trei gene implicate în răspunsul inflamator care au arătat o expresie diferențială foarte semnificativă la ficății normali și grași (Tabelul 2). Probabil, ortologii intermediarului de semnalizare a șoarecelui au fost în calea Toll conservată evolutiv (SITPEC), proteina care interacționează cu mitul (TOLLIP) și ARNm SIGIRR. Am confirmat o creștere a expresiei ARNm a acestor gene în ficatul gras în comparație cu ficatul normal (1, 71 ± 1, 03 vs 0, 90 ± 0, 19; 3, 28 ± 2, 24 vs. 1, 41 ± 0, 54; 0, 74 ± 0,30 vs. 0,48 ± 0,24, respectiv, Tabelul 4). Am analizat asocierea dintre expresia crescută a acestor gene și IMC. Am observat doar o tendință de corelație între nivelurile de ARNm TOLLIP și IMC (P = 0,0555). De interes a fost creșterea expresiei antigenului mitocondrial, IL-1R1, IGF2 și TGFB1 în majoritatea steatozei și steatohepatitei legate de VHC. IL1-R1 a fost întotdeauna puternic exprimată în steatohepatita sau obezitatea asociată cu alcoolul și în jumătate din steatoza asociată cu VHC (Tabelul 5). Figura 4 prezintă răspândirea uniformă a colorării IL1-R1 în țesutul hepatic. În schimb, IGF2 a fost exprimat în ficat normal și a fost observată doar o creștere a intensității imunomarcării.

Tabel în dimensiune completă

IL1-R1 se exprimă în citoplasma hepatocitelor în mod normal ( A ) și în ficatul gras ( b ). Imunoreactivitatea este mai intensă la exemplarele steatotice. ( A, b ) × 20.

Imagine la dimensiune completă

discuţie

Rezultatele noastre sugerează, de asemenea, că matricea extracelulară poate fi modificată față de etapele inițiale ale FLD. Acest lucru se poate datora concentrațiilor crescute de acizi grași intracelulari din parenchimul hepatic, care s-au dovedit deja a fi direct toxice pentru hepatocite, ducând la stres oxidativ, inflamație și fibrogeneză, dar nu la toxicitate mitocondrială. Acest lucru s-ar putea datora și supraexprimării genelor precum IGF2, IGFB4 și IGFBP acid labile acid sau Claudin 3 sau hepsina care acționează prin activarea celulelor/macrofagelor TGFB1 Kupffer sau a celulelor stelate care duc la remodelarea matricei extracelulare sau activarea celulelor ca în regenerarea ficatului sau activarea apoptozei în celulele hepatice pentru a controla greutatea hepatocitelor. Expresia proteinelor 35, 36, 37, 38 TGFB1 și IGF2 a fost crescută în majoritatea probelor care prezintă fie steatoză, fie steatohepatită și confirmă rezultatele noastre de profilare a expresiei genelor. Cu toate acestea, expresia bazală a IGF2 la ficatul nesteatotic a dus la dificultăți în interpretarea rezultatelor.

În concluzie, rezultatele noastre indică faptul că mitocondriile joacă un rol important încă din stadiile incipiente ale steatozei, posibil pentru a asigura catabolismul lipidic hepatic, cu fosforilare mitocondrială crescută și metabolism oxidativ. Deși nu s-au observat semne microscopice de inflamație la biopsiile hepatice, s-a observat o creștere a expresiei genelor sau proteinelor implicate în căile inflamatorii și/sau remodelarea matricei extracelulare, cum ar fi TGFB1, IL1-R1 și IGF2, în ficatul gras. IL1-R1 pare să joace un rol atât în ​​dezvoltarea steatozei, cât și a steatohepatitei și poate fi considerat un marker precoce și precis la pacienții cu risc de a dezvolta NASH.