lipsa

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Rezultatul
  • U mouse Slc39a14-/- sa dezvoltă deficite comportamentale și motorii progresive
  • Pierderea expresiei Slc39a14 duce la acumularea de Mn
  • Pierderea expresiei Slc39a14 modifică expresia diferiților transportatori de Mn în mai multe țesuturi
  • Ștergerea expresiei specifice hepatocitelor Slc39a14 nu duce la acumularea de Mn cu Mn standard în dietă
  • Mn cu o dietă bogată nu duce la acumularea de Mn hepatic în hepatocite specifice hepatocitelor Slc39a14- șoareci aruncați.
  • discuţie
  • Informatii suplimentare
  • Fișiere PDF
  • Informatii suplimentare
  • Videoclipuri
  • Film suplimentar S1
  • Film suplimentar S2
  • Film suplimentar S3
  • Film suplimentar S4
  • Film suplimentar S5

obiecte

  • Mecanismele bolii
  • Transportul proteinelor

abstract

În organism, homeostazia metalică este un proces complex care implică mai mulți transportori care sunt strâns reglementați de nivelul substratului lor și/sau de alte condiții de mediu. Creierul este deosebit de sensibil la efectele toxice ale metalelor, iar metalele se acumulează ușor în creier atunci când homeostazia metalelor este afectată [1, 2, 3]. Manganul (Mn), care este un element esențial pentru oameni, se găsește frecvent în creier, oase, ficat, pancreas și rinichi, iar dezechilibrul Mn este asociat cu afectarea funcției cerebrale [4, 5, 6, 7]. Până în prezent, au fost identificate mai multe proteine ​​de transport care joacă un rol în menținerea nivelurilor de Mn, inclusiv transportorul divalent de ioni-1 (DMT1) [8, 9, 10, 11], feroportina (Fpn1) [12], SLC39A8 ca ZIP8). [13, 14], SLC30A10 (cunoscut și ca ZnT10) [15, 16, 17] și SLC39A14 (cunoscut și sub numele de ZIP14) [4]. Cu toate acestea, mecanismele moleculare exacte care stau la baza homeostaziei Mn nu sunt bine cunoscute.

SLC39A14 a apărut pentru prima dată pentru rolul său în absorbția zincului în ficat ca răspuns la inflamația și infecția acută [28]. Mutațiile din SLC39A14 pot induce simptome de tip parkinsonism (asemănător PD) ca urmare a acumulării de Mn în diferite structuri cerebrale, în special în globul palid și striat [4]. În mod similar, mutațiile din alți transportori de Mn, cum ar fi SLC30A10, pot induce, de asemenea, neurotoxicitatea Mn și simptome asociate [15, 29, 30]. Cu toate acestea, în ciuda rolului stabilit al homeostaziei Mn în menținerea sănătății, rolul in vivo specific țesutului al transportorilor de Mn nu a fost clar definit.

Aici, raportăm că șoarecii globali Slc39a14-knockout (Slc39a14 -/-) și hepatocitele specifice șoarecilor Slc39a14-knockout (Slc39a14 fl/fl; Alb-Cre +) au fenotipuri și distribuții metalice tisulare diferite legate de Mn. În special, deși șoarecii Slc39a14 -/- recapitulează hipermanganesemia care apare la pacienții cu sindrom asemănător PD [4], nu s-a observat nicio acumulare de Mn în creier sau în alte țesuturi de șoareci Slc39a14 fl/fl; Alb-Cre +, care au niveluri semnificativ mai mici de Mn în ficat. Aceste descoperiri oferă o nouă perspectivă asupra rolului fiziologic al SLC39A14 ca important importator de Mn în ficat și oferă o nouă lumină asupra efectelor clinice ale perturbării homeostaziei Mn.

Rezultatul

Slc39a14 -/- șoarecii dezvoltă deficite comportamentale și motorii progresive

În conformitate cu rapoartele anterioare [31, 32], planatoarele noastre homozigote Slc39a14 (Slc39a14 -/-) sunt viabile și nu prezintă anomalii morfologice aparente la naștere. Cu toate acestea, până la vârsta de 4 săptămâni, acești șoareci încep să prezinte semne de torticolis aleatoriu progresiv și deficite motorii (Figura 1a; film complementar S1, film complementar S2, film complementar S3, film complementar S4, film complementar S5). În comparație cu așternuturile de tip sălbatic, șoarecii Slc39a14 -/- au o greutate corporală mai mică de la vârsta de 8 săptămâni (Figura 1b). La vârsta de șase luni, șoarecii Slc39a14 -/- au început să prezinte semne de distonie cu o incapacitate progresivă de a-și coordona activitatea motorie (Figura 1c-i); aceste simptome sunt similare cu insuficiența motorie asemănătoare PD la pacienții cu mutație în SLC39A14 [4].

Pierderea expresiei Slc39a14 duce la acumularea de Mn

Se raportează că Slc39a14 transportă mai multe metale, inclusiv Mn [4], zinc (Zn) [31] și fier (Fe) [40]. Prin urmare, am folosit spectrometria de masă cu plasmă cuplată inductiv (ICP-MS) pentru a măsura nivelurile diferitelor metale la șoareci Slc39a14 -/- și de tip sălbatic [41, 42, 43]. Interesant, comparativ cu controalele de tip sălbatic potrivite pentru vârstă, șoarecii Slc39a14 -/- în vârstă de 48 de săptămâni au avut niveluri semnificativ mai mari de Mn într-o gamă largă de țesuturi, inclusiv ser, creier, rinichi, plămâni, inimă și splină (Figura 2a); Nivelurile de Mn hepatic și intestinal au fost similare la șoarecii de tip sălbatic și Slc39a14 -/-. Nu am găsit diferențe semnificative între șoareci de tip sălbatic și șoareci Slc39a14 -/- în ceea ce privește Fe, Zn sau Cu în niciun țesut (Figura 2b-d), cu excepția unei creșteri ușoare, dar marcate, a nivelurilor serice de Fe (Figura 2b În general, aceste date sugerează că Slc39a14 este predominant transportorul Mn.

La șoareci slc39a14 -/-, Mn se acumulează în diferite țesuturi. ( A - d ) Mn nivele ( A ), Fe ( b ), Zn ( c ) și Cu ( d ) au fost măsurate în țesuturile indicate de șoareci de tip sălbatic (WT) și Slc39a14 -/- (KO) la> 24 săptămâni prin ICP-MS (n = 4 șoareci/grup). La punct si da rețineți ruptura axei y pentru serul Mn. * P -/- tratat timp de patru săptămâni cu Na2 CaEDTA (370 mg/kg greutate corporală) sau ser fiziologic (n = 8-12 șoareci/grup, vârstă 5 luni). f ) rezultatele testului rotarod la șoareci Slc39a14 -/- tratați cu Na2 CaEDTA sau soluție salină timp de patru săptămâni (n = 8-12 șoareci/grup, vârstă 5 luni). ÎN e A f, * Nivelurile de P -/- Mn din creier care sunt

De 10 ori mai mare decât șoarecii martor de tip sălbatic asortat cu vârsta. Prin urmare, am testat dacă efectele acumulării de Mn pot fi reduse prin tratarea șoarecilor cu un chelator de metal Na2 CaEDTA. La vârsta de 5 luni, am tratat șoareci de tip sălbatic și Slc39a14 -/- Na2 CaEDTA timp de 4 săptămâni folosind un protocol terapeutic standard [44, 45]. Terapia de chelare nu a avut niciun efect asupra nivelurilor serice de Mn (Figura 2e) sau asupra performanței rotarodului (Figura 2f) la șoareci de tip sălbatic; totuși, la șoareci Slc39a14 -/-, tratamentul cu CaEDTA cu Na2 a redus semnificativ nivelurile serice de Mn (de la 0,1 ng μl -1 la 0,05 ng μl -1; Figura 2e) și a îmbunătățit semnificativ performanța rotarodului (Figura 2f).

Pierderea expresiei Slc39a14 modifică expresia diferiților transportori de Mn în mai multe țesuturi

Niveluri de expresie ale diferiților transportatori Mn la șoareci de tip sălbatic și Slc39a14 -/-. Nivelurile de ARNm Slc39a8, Slc13a5, Slc2a4, Dmt1, Fpn1 și Slc30a10 au fost măsurate în ficat ( A ), latra ( b ), hipocamp ( c ), cerebel ( d ), inima ( e ), rinichi ( f ), splină g ) pancreas ( h ), intestin ( eu ) șoareci de tip sălbatic (WT) și Slc39a14 -/- (KO)> 24 de săptămâni. (n = 4 șoareci/grup). ND înseamnă nedetectat, * P fl/fl; Șoareci Alb-Cre +) folosind o strategie de eliminare condiționată (Figura 4a). Gena Slc39a14 murină codifică două izoforme care conțin fie exonul 5a, fie 5b [32]. Prin urmare, ne-am concentrat asupra exonului 4, care introduce un codon de oprire prematur în ambele izoforme (Figura 4a). Analiza QPCR a confirmat că expresia hepatică Slc39a14 a fost practic eliminată în Slc39a14 fl/fl; Șoareci Alb-Cre + comparativ cu șoareci martori (Figura 4b).

Mn dietetic bogat nu duce la acumularea de Mn hepatic la șoarecii slc39a14-knockout specifici hepatocitelor.

Având în vedere acumularea sistemică de Mn la șoareci Slc39a14 -/- și ficatul este locul principal de stocare pentru captarea Mn mediată de Slc39a14, am emis ipoteza că șoarecii F/39a14 fl/fl specifici hepatocitelor au fost hrăniți; Șoarecii Alb-Cre + o dietă bogată în Mn pot crește nivelul de Mn din creier. Prin urmare, am hrănit noul Slc39a14 înțărcat fl/fl; Alb-Cre + și șoarecii martor (Slc39a14 fl/fl; Alb-Cre -) au purificat dieta AIN-93G conținând fie concentrație normală (10 ppm), fie mare (2.400 ppm) Mn [48]. După 30 de zile cu o dietă bogată în Mn, nici greutatea corporală (Figura 5a), nici performanța rotativă (Figura 5b) nu au diferit între greutatea corporală Slc39a14 fl/fl, Alb-Cre + și șoarecii martor; de asemenea, nu am găsit nicio diferență între șoarecii hrăniți cu o dietă normală cu Mn și șoarecii hrăniți cu o dietă bogată în Mn (comparați Figura 5a și b cu Figurile 4c și d)). Cu toate acestea, o dietă bogată în Mn a crescut nivelurile serice de Mn la șoarecii Slc39a14 fl/fl; Alb-Cre + și șoareci de control, cu un efect mult mai puternic asupra șoarecilor slc39a14 fl/fl; Alb-Cre + (Figura 5c).

discuţie

Aici, am caracterizat rolul transportorului de ioni metalici Slc39a14 în metabolismul sistemic al Mn utilizând șoareci Glc39a14-knockout globali și șoareci Slc39a14-knockout specifici hepatocitelor. Rezultatele noastre indică faptul că Slc39a14 hepatic are un rol specific în menținerea homeostaziei Mn sistemice. În special, am constatat că Slc39a14 reglează absorbția Mn în principal în ficat, care la rândul său mediază nivelurile de Mn în alte țesuturi, inclusiv creierul, inima, rinichii și circulația. Rezultatele noastre arată în continuare că Slc39a14 funcționează pentru a regla influxul de Mn în ficat deoarece șoarecii Slc39a14 -/- dezvoltă acumularea de Mn în creier și alte țesuturi, dar nu și în ficat. Am constatat în plus că șoarecii slc39a14-knockout specifici hepatocitelor nu prezintă semne de acumulare de Mn în condiții normale de alimentație cu Mn; cu toate acestea, după ce au luat o dietă bogată în Mn, acești șoareci dezvoltă niveluri ridicate de Mn în creier și ser, dar nu și în ficat. În ansamblu, aceste constatări sugerează că Slc39a14 hepatic reglează homeostazia Mn prin medierea absorbției Mn în ficat, oferind informații despre funcția SLC39A14 la om.

Menținerea homeostaziei Mn este esențială pentru sănătatea umană, iar excesul de Mn este asociat cu acumularea de Mn în creier și neurodegenerare [49, 50]. Mutațiile transportorilor de Mn SLC39A14 și SLC30A10 au fost asociate cu niveluri crescute de Mn din ser și creier [4, 30] și dezvoltarea simptomelor asemănătoare PD. În plus, expunerea la surse ocupaționale și la alte surse de mediu cu un conținut ridicat de Mn poate provoca simptome neurologice similare [50, 51]. Pacienții cu mutație homozigotă în SLC39A14 au niveluri crescute de Mn în sânge și creier la o vârstă fragedă și dezvoltă distonie-parkinsonism [4]. Cu toate acestea, spre deosebire de pacienții cu mutație în SLC30A10, acești pacienți nu au niveluri crescute de Mn hepatic sau dezvoltă boli hepatice. În plus, Tuschl și colab. a șters expresia Slc39a14 în pește zebră și a găsit niveluri ridicate de Mn în creier, dar nu și în intestinele abdominale. În contrast, experimentele noastre folosind modele knock-out de șoarece oferă o relație de cauzalitate între funcția SLC39A14, importul de Mn hepatic și neurotoxicitatea legată de Mn. Din păcate, nu ar fi posibil să se efectueze aceste experimente pe oameni.

O constatare cheie a studiului nostru este că SLC39A14 joacă un rol central în reglarea absorbției Mn în ficat. Am constatat că îndepărtarea selectivă a expresiei Slc39a14 în hepatocite nu provoacă supraîncărcare de Mn în creier, sânge sau alte țesuturi. În schimb, șoarecii globali cu excluderea slc39a14 au întrerupt reglarea metabolismului Mn, iar pacienții cu mutație SLC39A14 au dezvoltat deficite comportamentale și motorii similare cu cele ale tulburărilor de mișcare [4]. Analiza noastră a șoarecilor secretori de hepococite care secretă hepatocite sugerează că acumularea de Mn în sânge și creier nu rezultă doar din absorbția de Mn afectată în ficat. Deși șoarecii Slc39a14 -/- au fost raportați anterior că au redus aportul de zinc și au crescut absorbția fierului [31], datele noastre ICP-MS arată că șoarecii Slc39a14 -/- au niveluri normale de Fe, Zn și Cu în țesut (cu singura excepție: niveluri crescute de Fe în ser). În ansamblu, datele noastre oferă dovezi convingătoare că ștergerea globală a expresiei Slc39a14 afectează în primul rând metabolismul Mn, dar are un efect redus asupra metabolismului Fe, Zn sau Cu, sugerând că Slc39a14 funcționează în primul rând ca transportor Mn.

Mecanismul care stă la baza toxicității Mn este puțin înțeles. Deși sistemul nervos central este o țintă primară bine-cunoscută pentru Mn, modul în care Mn este transportat prin bariera hematoencefalică este în prezent necunoscut. Pe baza rezultatelor noastre, credem că SLC39A14 nu mediază direct absorbția Mn în creier; mai degrabă, SLC39A14 hepatic are efecte sistemice asupra homeostaziei Mn. La om, Mn alimentar este administrat în ficat, unde formează un conjugat cu bilă și este apoi excretat în intestin [52, 53]. La mamifere, Mn este secretat în părțile caudale ale tractului intestinal [26]. Deoarece Slc39a14 este exprimat pe membrana basolaterală a celulelor mucoasei din intestinul proximal [54], este posibil ca Slc39a14 să joace un rol în secreția de Mn din intestinul proximal. Datele noastre sugerează în continuare că diferențele de sensibilitate la acumularea de Mn între diferite țesuturi pot fi atribuite diferitelor distribuții de țesuturi ale transportatorilor principali de Mn.

Toxicitatea Mn a fost direct asociată cu tulburări de comportament și locomotorii la modelele umane și animale [51, 55], iar Ca2TA Na2 este adesea utilizat pentru a chela niveluri ridicate de metale grele, deși cu rezultate mixte. De exemplu, terapia de chelare Ca2TA Na2 a redus încărcarea Mn și a inversat neurotoxicitatea legată de Mn la un pacient cu mutația SLC39A14, dar nu a avut niciun efect la un alt pacient cu aceeași mutație [4]. Am constatat că șoarecii secretori de Slc39a14 excretau deficite comportamentale și motorii asociate cu niveluri ridicate de Mn în creier și tratamentul cu Na2CaEDTA a redus semnificativ Mn seric și a îmbunătățit funcția locomotorie la acești șoareci.

Model schematic care arată rolul Slc39a14 hepatic la nivelurile Mn intracelulare și sistemice. (Sus) În condiții dietetice normale de Mn cu niveluri normale de Slc39a14 (stânga), Mn este absorbit de hepatocite prin intermediul transportorului Mn Slc39a14 (prezentat în roșu) și poate fi exportat prin intermediul exportatorului Mn Slc30a10 (prezentat în verde). În schimb, pierderea expresiei Slc39a14 duce la niveluri semnificativ reduse de Mn în hepatocite (dreapta). (Partea de jos) Consumul unei diete bogate în Mn nu reușește să depășească nivelurile scăzute de Mn în hepatocitele care secretă slc39a14, ducând la o creștere a acumulării sistemice de Mn.