modele

  • abstract
  • Principalul
  • Porcii ca model experimental
  • Fibroză chistică
  • Retinita pigmentară
  • cancer
  • Crearea porcilor cu inginerie genetică
  • NSRRC
  • import
  • Derivarea și monitorizarea sănătății
  • Distribuirea probelor și a animalelor vii
  • Modele personalizate modificate genetic generate de PI
  • crioconservare
  • Cercetare și cercetare contra cost
  • concluzii

abstract

Porcii devin din ce în ce mai importanți ca model biomedical. Datorită similitudinilor dintre porci și oameni, o mai bună înțelegere a biologiei de bază a sănătății și bolilor umane poate proveni de la porci, mai degrabă decât de la modelele clasice de rozătoare. Având în vedere nevoia tot mai mare de modele de porci, este esențial ca instrumentele, modelele și serviciile genomice să fie disponibile comunității științifice. Multe dintre ele sunt disponibile prin intermediul Centrului Național pentru Resurse și Cercetare a Porcilor (NSRRC), o facilitate finanțată de Institutele Naționale de Sănătate din SUA de la Universitatea din Missouri. NSRRC își propune să ofere comunității științifice modele de înaltă calitate a porcilor biomedici.

Principalul

Modelele de animale modificate genetic au permis progrese fără precedent în cercetarea biomedicală. Multe organisme sunt folosite pentru a produce modele modificate genetic, cum ar fi șoareci, șobolani, oi, bovine 1 și porci 2. Toate aceste specii au furnizat informații care sunt valoroase pentru înțelegerea biologiei subiacente, precum și patogeneza multor boli umane. Cu toate acestea, unele modele au limitări în capacitatea lor de a recapitula o boală sau sindrom uman. De exemplu, șoarecii și șobolanii nu sunt modelul animal optim pentru studierea ochiului uman sau efectuarea unei intervenții chirurgicale ortopedice datorită limitărilor dimensiunii ochiului sau osului și articulațiilor. În plus, modelele clasice de rozătoare nu recapitulează întotdeauna complet bolile umane, cum ar fi fibroza chistică (CF) 3. .

Porcii au multe avantaje față de alte specii ca model biomedical și sunt considerați modelul optim pentru xenotransplant, evaluarea riscului de contaminare a mediului și descoperirea medicamentelor. În multe privințe, porcul este mai asemănător decât în ​​alte modele în ceea ce privește anatomia, fiziologia și fiziopatologia; filogenetic, porcii la nivel de nucleotide sunt de trei ori mai aproape decât șoarecii 4. În prezent, avem o cantitate vastă de informații despre porci după utilizarea sa în agricultură, acoperind toate aspectele anatomiei și fiziologiei sale, variind de la răspunsurile genetice de bază la mediu până la aspecte aplicate, cum ar fi adăpostirea 5. În plus, suntem capabili să aplicăm numeroase progrese în tehnologiile medicale care au fost dezvoltate pentru oameni la modelul porcului, cum ar fi imagistica prin rezonanță magnetică și scanarea tomografică cu emisie de pozitroni, iar antrenamentul chirurgical a fost efectuat în mod curent la porci. În această revizuire, vom discuta despre valoarea porcilor ca model biomedical, precum și despre instrumentele și serviciile genomice, precum NSRRC, care sunt disponibile pentru a facilita utilizarea acestuia în cercetarea sănătății umane și a bolilor.

Porcii ca model experimental

Deși este un model excelent în starea sa naturală, cel mai mare efect al porcilor din comunitatea biomedicală este probabil din rolul său de model de inginerie genetică pentru o anumită boală umană. Aici vom discuta trei cazuri în care porcii prelucrați genetic s-au dovedit a fi modele avantajoase.

Fibroză chistică

CF este o tulburare autosomală recesivă cauzată de o mutație a genei CFTR care reglează transportul anionului. La aproximativ 70% dintre persoanele cu CF, mutația din CFTR este o ștergere a celor trei perechi de baze care codifică aminoacidul 508 (fenilalanină) al proteinei CFTR 3. Unele dintre simptomele CF includ blocarea mucusului (ileus meconiu), canalele pancreatice blocate, vezica biliară rigidizată și boala pulmonară 3. Când gena CFTR este mutată într-un model de șoarece, canalul anionic nu este funcțional, dar nu se observă simptome clasice ale CF. Cu toate acestea, atunci când animalul model este un porc cu mutație umană (adică o eliminare a fenilalaninei 508), 100% dintre purcei prezintă simptome clasice ale CF incluzând ileus de meconiu, leziuni hepatice și boli pulmonare 3. Modelul actual de porc este utilizat pentru examinarea invazivă a bolilor pulmonare pentru a dezvolta noi terapii.

Retinita pigmentară

Modelele de porci joacă un rol dominant în studiile asupra retinitei pigmentare (RP) 11. RP este o tulburare autosomală dominantă umană în care o formă obișnuită a bolii rezultă din substituirea histidinei cu aminoacid prolină la poziția 23 (P23H) din gena RHO. RP se caracterizează prin apariția orbirii nocturne, pierderea vederii periferice și apoi pierderea vederii centrale 12. În 2012, Ross și colab. 13 a dezvoltat un model de porc în miniatură consangvinizat pentru RP care a reprodus fenotipul uman. Transgenul uman cu mutația P23H din gena RHO umană a fost introdus aleatoriu în genomul porcin și au fost obținute o serie de fenotipuri13. Deși există mai multe alte modele RP care au recapitulat boala, avantajul modelului porc este similaritatea biologică dintre porc și ochiul uman. Un alt avantaj al acestui model de porc este acela că fundalul genetic miniatic consangvinizat al porcilor facilitează dezvoltarea terapiilor celulare. Cercetătorii pot injecta cantități mari de inocul în ochii porcilor, permițându-le să studieze efectele terapiilor celulare fără efecte confuze ale respingerii 14. Acest model a fost utilizat în mai multe experimente, cum ar fi determinarea dacă un supliment de curcumină poate opri sau întârzia degenerarea fotoreceptorilor de tijă. .

cancer

Cancerul este o colecție mare de boli care sunt caracterizate de obicei prin creșterea anormală a celulelor. Mutațiile din KRAS reprezintă aproximativ un sfert din cancerele umane, iar mutațiile din p53 reprezintă încă o treime. Am dezvoltat un model inductibil al cancerului porcin cu un codon stop floxificat între promotorul beta-actinei de pui și formele mutante ale KRAS G1D2 și p53 R172H. Acest model de cancer de porc permite inducerea tumorilor în orice țesut sau organ prin administrarea de recombinază CRE în țesutul dorit. CRE promovează recombinarea între două site-uri loxP și elimină codonul stop. Îndepărtarea codonului stop duce la transcrierea și traducerea ulterioară a celor două gene care induc cancerul. Lucrarea inițială in vitro cu celule izolate de la animale fondatoare a relevat că transgenul era funcțional atunci când adenovirusul a fost utilizat pentru a livra Cre celulelor in vitro. Morfologia celulară, timpul de divizare și timpul de migrare celulară au fost diferite în linia celulară a modelului de cancer comparativ cu liniile de control 16. În plus, 12 din cei 14 șoareci injectați cu celule ale modelului de carcinom porcin indus de adeno-Cre au dezvoltat tumori măsurabile. În cele din urmă, tumorile au fost induse de adeno-Cre în trei situri diferite în porc KRAS G1D2 și p53 R172H 16 .

Crearea porcilor cu inginerie genetică

Tehnologiile pentru producerea modificărilor genetice ale genomului porcului au evoluat semnificativ în ultimele trei decenii. Din punct de vedere istoric, ingineria genetică a porcilor a fost efectuată prin adăugarea de transgene la siturile aleatorii din genom. Folosind o tehnică de microinjecție, constructele genomice au fost inserate în zigoturile pronucle 17, ducând la evenimente de inserție aleatorii cu potențialul de a provoca mutații de inserție 18. Inserțiile pot apărea ca una sau mai multe copii ale transgenei care se integrează la unul sau mai multe situri din genom. În plus față de randomitatea inserției, unele dintre transgenele injectate se pot integra numai după scindarea zigotului, adică în timpul etapei cu două celule. Integrarea în timpul etapei cu două celule poate avea loc în diferite locuri (sau deloc) din genomul celor două blastomere, ducând la un embrion mozaic și la un animal 19. Dacă descendența celor doi blastomeri a contribuit diferit la linia germinativă, atunci transgenul poate sau nu să fie transferat descendenței. Dar chiar și cu aceste avertismente, transgenea prin injecție pruclear este încă un instrument puternic pentru producerea de noi proteine ​​la porci.

Progresele recente și cele mai importante în ingineria genetică a porcilor sunt utilizarea tehnologiilor de inginerie genetică, cum ar fi zincul și nucleazele degetelor 29, 30, nucleazele efectoare 31, 32, 33, precum activatorul transcripțional și grupările repetate palindromice scurte la distanță regulată. Sistem Cas9 (CRISPR/Cas9) 34. Aceste instrumente sunt extrem de eficiente și pot fi proiectate pentru a nu lăsa urme genetice, cum ar fi un marker selectabil. De fapt, sistemul CRISPR/Cas9 este atât de eficient încât injecția în zigote (dacă CRISPR-urile individuale sunt presetate) poate avea ca rezultat faptul că toți descendenții au alele modificate 34. Sistemul CRISPR/Cas9 ne-a permis să edităm genomul porcin prin ștergerea genelor și vizarea inserțiilor ADN-ului donatorului; are chiar potențialul de a modifica o bază din genom. Datorită noilor tehnici de modificare a genelor, este posibil să se prevadă crearea practic a oricărei modificări sau combinații de modificări la porci, eliminând astfel orice bariere genetice rămase care și-au limitat utilizarea în trecut.

NSRRC

Tabel în dimensiune completă

import

Mulți cercetători au dezvoltat deja modele pentru aplicații specifice. Cu toate acestea, menținerea liniei și răspunsul la solicitările altor anchetatori poate fi dificil pentru facilitățile independente. NSRF poate ameliora sarcina de distribuire a donatorului de investigație. Modelele existente pot fi donate către NSRRC, unde vor fi menținute și puse la dispoziția altor cercetători. Anchetatorii pot dona modelul NSRRC, cu condiția ca modelul să poată fi distribuit în mod liber către alți anchetatori din instituții non-profit. Donatorul care investighează va furniza NSRRC informațiile necesare despre model, cum ar fi modificarea genetică (dacă există), fenotipul, cererile anticipate pe an pe linie, starea de sănătate și fondul tulpinii. Comitetul consultativ NSRRC va stabili apoi dacă modelul donat va fi acceptat în centru. La admitere, anchetatorul și CRSN-ul ar stabili apoi modelul planului de donație. Donațiile tipice sunt fie prin probe înghețate, cum ar fi spermatozoizii, colectarea de tipuri de celule specifice pentru clonare sau crioconservare, sau sub formă de animale vii, dacă condițiile de sănătate permit acest lucru.

Derivarea și monitorizarea sănătății

Toate modelele NSRRC sunt găzduite fie într-o unitate de locuințe standard, fie în unitatea noastră specială fără patogeni. Modelele donate de NSRRC sunt redirecționate către una dintre aceste facilități de eliminare a agenților patogeni de la instituția donatoare. Re-derivarea poate fi realizată prin mai multe metode, care pot include operația cezariană pură, transferul embrionilor, inseminarea sau celulele utilizate pentru transferul nuclear al celulelor somatice. Monitorizarea de rutină a animalelor din instalațiile noastre înainte, în timpul și după re-derivare asigură faptul că modelele din NSRRC au cele mai înalte standarde de sănătate. Sănătatea este monitorizată pentru boli, inclusiv virusul reproducerii și bolilor respiratorii ale porcilor, Leptospira, Mycoplasma hyopneumoniae, circovirus II porcine și, mai recent, virusul porcilor și delta-coronavirusului. Testele pentru alte boli evoluează și evoluează conform cerințelor programelor de cercetare ale investigatorului principal (PI). Un exemplu este dezvoltarea și validarea unui test cu citomegalovirus, deoarece infecția secundară cu citomegalovirus poate duce la eșecul organelor de porc care sunt transmise babuinului 35. Monitorizarea multor agenți patogeni se efectuează folosind teste dezvoltate de NSRRC pentru testarea internă a probelor fecale, orale sau de sânge.

Distribuirea probelor și a animalelor vii

Datorită facilităților limitate și a expertizei porcilor în multe locuri, NSRRC poate furniza probe specifice fără ca anchetatorul să fie nevoit să reînnoiască infrastructura și expertiza existente. Anchetatorul poate solicita toate modelele de porci disponibile prin NSRRC. Modelele pot fi distribuite ca celule, țesuturi, organe sau animale vii. Un exemplu de eșantioane distribuite prin NSRRC este dat în Tabelul 2. Când cercetătorul solicită eșantioane, NSRRC pregătește animalele pentru eșantionare. În cazul eșantioanelor prelevate de personalul NSRRC, anchetatorului solicitant i se solicită să furnizeze un protocol detaliat de eșantionare, precum și detalii privind condițiile de transport. Anchetatorul solicitant poate prelua, de asemenea, eșantioane personal, vizitând instalația NSRRC.

Tabel în dimensiune completă

Pe lângă eșantioane, animalele vii pot fi distribuite anchetatorilor solicitanți. Animalele pot fi trimise la instituții pentru testare specifică, terapie nouă sau prelevare de probe. Instituțiile pot accepta, de asemenea, animale pentru a-și stabili propria colonie de reproducere. Animalele vii părăsesc de obicei NSRRC cel mai devreme la vârsta de 4 până la 5 săptămâni, astfel încât animalele sunt înțărcate și începute înainte de transport pe hrană solidă; cu toate acestea, în unele situații, nou-născuții pot fi transportați. NSRRC va colabora cu investigatorul solicitant și cu unitatea de primire pentru a determina cea mai bună modalitate de distribuire a animalelor și pentru a se asigura că starea de sănătate a instituției primitoare nu este compromisă.

Modele personalizate modificate genetic generate de PI

Orice anchetator principal poate solicita NSRRC să dezvolte un model de porc personalizat. Dacă investigatorul este finanțat de NIH, NSRRC poate produce în prezent acest model gratuit pentru anchetatorul solicitant; cu toate acestea, după caracterizarea modelului, acesta se va răspândi liber. Datorită faptului că modelele sunt distribuite, obligația politicii de partajare NIH pentru subvenția PI NIH este îndeplinită. IP-urile care nu au finanțare NIH pot solicita și propriile modele, dar în aceste cazuri modelul nostru este evaluat de comitetul nostru consultativ. Modelul cerut trebuie să îndeplinească următoarele criterii: poate fi utilizat în mai multe discipline și este probabil să fie foarte solicitat. În cazul în care Comitetul consultativ respinge cererea pentru model sau dacă anchetatorul dorește să restricționeze distribuția modelului, producția poate fi solicitată pe baza tarifelor pentru servicii. Personalul NSRRC vă poate ajuta cu toate aspectele modelării, de la proiectare și dezvoltare la îngrijirea animalelor fondatoare. În prezent, folosim instrumente de modificare a genelor (CRISPR/Cas9) pentru a produce multe dintre modelele necesare 34. NSRRC produce de obicei trei până la cinci modele pe an.

crioconservare

Plasma de la toate animalele modificate genetic și de tip sălbatic este păstrată într-o varietate de formate, inclusiv embrioni, celule somatice și spermă. Crioconservarea oferă NSRRC capacitatea de a menține linii fără producție continuă, precum și de a preveni pierderile catastrofale din cauza focarelor de boli. Pentru a asigura întreținerea liniei, eșantioanele duplicate sunt stocate în afara amplasamentului în depozitul secundar. Probele crioconservate pot fi trimise anchetatorului solicitant pentru a crea animale la fața locului la sediul lor. În plus, NSRF poate furniza investigatorului servicii de crioconservare și depozitare pentru modelul lor de porc modificat genetic; cei care nu doresc să-și doneze modelele pot primi în continuare servicii, dar pe baza taxelor de serviciu.

Cercetare și cercetare contra cost

NSRRC desfășoară activități de cercetare care vor beneficia de productivitatea sa în ceea ce privește îndeplinirea funcțiilor sale. NSRRC efectuează cercetări în domeniile ingineriei genetice, transferului nuclear al celulelor somatice, crioconservării și dezvoltării testelor de monitorizare a sănătății. În plus, NSRF va ajuta anchetatorii cu proiectele lor de cercetare biomedicală. Personalul NSRRC și anchetatorii care vor solicita vor discuta proiectul pentru a stabili dacă este posibil ca NSRRC să efectueze cercetări la unitatea sa. Implementarea proiectelor foarte solicitante și a proiectelor care necesită echipamente extrem de specializate poate fi mai solicitantă pentru NSRRC și poate fi necesară efectuarea în unitatea IM solicitantă. Anchetatorul și NSRRC vor discuta, de asemenea, despre bugetul și perioada de timp necesare pentru finalizarea proiectului.

concluzii

În ultimul deceniu, a existat o creștere semnificativă a utilizării porcilor ca modele pentru sănătatea și bolile umane. Indiferent dacă sunt utilizate în stare naturală sau modificate genetic, modelele de porci devin modelul biomedical ales, în mare parte datorită capacității lor tot mai mari de a recapitula diferite boli umane. Cu expertiză și echipamente limitate în toată țara, necesitatea unui centru central de resurse a devenit o prioritate. NSRRC a fost înființat pentru a servi ca depozit pentru modele valoroase de porci pentru cercetare biomedicală, mutând povara întreținerii și distribuirii modelelor de porci de la cercetător la o resursă națională. În plus, NSRRC creează și distribuie proprii porci generați de modelele PI. Suntem aici pentru a ajuta comunitatea de cercetare a porcilor să pună bazele cercetării lor biomedicale.