nivelurile

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Rezultatul
  • discuţie
  • metode
  • Culturi celulare
  • Analiza lipidelor
  • qPCR
  • Mai multe detalii
  • Comentarii

obiecte

abstract

La plantele superioare, acizii grași (FA) cu 18 atomi de carbon (18 ° C) reprezintă aproximativ 70% din FA totală, cele mai abundente specii sunt 18: 2 și 18: 3. Aceste două FA polinesaturate (PUFA) reprezintă aproximativ 55% din toate FA în culturi. Suspensiile de celule Arabidopsis, în timp ce 18: 1 reprezintă aproximativ 10%. Nivelul PUFA poate varia în funcție de factori slab definiți. Aici, am comparat diferite seturi de culturi de celule vegetale și am găsit o corelație între rata de creștere a populației de celule și nivelul de nesaturare FA 18C. Aceste observații sugerează că nivelul final al PUFA poate depinde în parte de rata diviziunii celulare și că desaturazele FAD2 și FAD3, care sunt responsabile pentru formarea 18: 2 și 18: 3 pe fosfolipide, au activități de limitare rapidă. - cultivarea culturilor. În cultura de celule vegetale, privarea de fosfat (Pi) este cunoscută pentru a perturba diviziunea celulară și a declanșa remodelarea lipidelor. Am constatat că foamea Pi nu a avut niciun efect asupra expresiei genei FAD și că nivelurile PUFA în această situație s-au corelat și cu rata de creștere. Astfel, nivelurile PUFA par a fi un semn distinctiv în determinarea maturității și îmbătrânirii celulelor.

Glicerolipidele sunt componente majore ale arhitecturii membranei. Aceste acil lipide sunt diester de acizi grași (FA) și glicerol, iar grupele FA pot fi saturate sau nesaturate. La plantele superioare, principalele specii de FA sunt 16 ° C și 18 ° C, reprezentând aproximativ 30 și 70% din totalul FA 1. Aceste FA sunt prezente cu diferite niveluri de saturație, de obicei nu prezintă (16: 0, 18: 0) până la trei (16: 3, 18: 3) duble legături pentru speciile majore. Cele mai frecvente tipuri de FA sunt 18: 2 și 18: 3, reprezentând aproximativ 80% din 18 ° C și aproape 55% din FA totală în culturile cu suspensie de celule Arabidopsis, în timp ce 18: 1 reprezintă aproximativ 10% din FA total 1 .

Acizii grași nesaturați joacă un rol cheie în structura și funcția membranei. Gradul de saturație afectează nu numai proprietățile fizico-chimice ale FA, cum ar fi punctul de topire sau vâscozitatea 12, ci și forma moleculară a lipidei de care este atașat 13. La rândul său, acest lucru afectează comportamentul lipidelor de membrană și a ambalajelor bistratificate. De exemplu, fosfatidiletanolaminele saturate (PE) formează o fază lamelară, în timp ce PE nesaturat formează o fază 14, 15 HII hexagonală (non-lamelară inversată). Ca urmare, enzimele implicate în formarea acizilor grași nesaturați joacă un rol major în formarea, funcția și integritatea membranei.

În plus față de aceste efecte de mediu cunoscute asupra nivelului de nesaturare a FA, alți factori nedefiniți pot modifica nivelul PUFA. Acest lucru este evident în culturile de suspensie celulară, în care întinderea PUFA poate varia de la o cultură la alta, ceea ce uneori face dificilă compararea rezultatelor. Într-un efort de a înțelege mai bine ce cauzează astfel de variații, am măsurat efectul ritmului de creștere asupra distribuției PUFA în modelele noastre de plante. Folosind culturi de suspensii celulare care conțin în principal fosfolipide, am observat o corelație între rata de creștere și nivelul de nesaturare FA 18C, sugerând că desaturazele FAD2 și FAD3 pot avea activități limitative în culturile cu creștere rapidă și că nivelul final de nesaturare poate depinde, de asemenea. privind rata de distribuție a populației de celule vegetale.

Rezultatul

Trei modele de culturi de suspensie de celule au fost folosite pentru a studia metabolismul lipidic la plantele superioare: celulele stem Acer pseudoplatanus (Sycamore), celulele meristemului de frunze Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) și culturile de calus de celule Arabidopsis meristem. În aceste culturi, lipidele de membrană sunt în principal fosfolipide (80 până la 90%), cu o cantitate mică de galactolipide (10 până la 20%) 23. De fapt, aceste celule cresc fie heterotrofic (celule Sycamore, celule Arabidopsis calli), fie mixotrop (celule Arabidopsis calli) și prezintă doar amiloplaste (celule Sycamore și Arabidopsis calli) sau membrane tilacoide slab dezvoltate cu clorofilă (celule Arabidopsis). Acest lucru sugerează că PUFA-urile din modelele noastre de plante sunt generate în mare parte de sistemul FAD2/FAD3 din ER, cu un beneficiu mic, dar semnificativ, al perechii FAD6/FAD7 în plastide. Această compoziție este foarte diferită în frunze, unde galactolipidele reprezintă mai mult de 60% din glicerolipide 24, sugerând că FAD2 și FAD3 nu pot fi furnizorii principali de PUFA în aceste țesuturi.

( A ) un experiment reprezentativ care arată greutatea proaspătă și dezvoltarea lipidelor după transferul celulelor în mediu proaspăt. În ziua 7, o alicotă a suspensiei celulare a fost transferată în mediu proaspăt proaspăt pentru un nou ciclu de creștere. O alicotă a fost luată zilnic pentru analiza acizilor grași. ( B ) principala distribuție a FA în celulele Sycamore cultivate așa cum este descris în (A).

Imagine la dimensiune completă

După 8 zile de creștere, s-au măsurat distribuția greutății proaspete și a acizilor grași. Greutatea inițială proaspătă a fost de 1,5 ± 0,2 g pentru fiecare cultură. ( A ) o curbă de corelație între raportul 18: 1 și greutatea proaspătă a Arabidopsis calli. ( B ) curba de corelație între raportul PUFA (18: 2 + 18: 3) și greutatea proaspătă a Arabidopsis calli. Factorii de corelație R2 au fost calculați prin regresie liniară utilizând software-ul GraphPad Prism. ( C ) FA totală în culturi crescute fie în prezența, fie în absența Pi. ( D ) distribuția glicerolipidelor polare majore (MGDG și DGDG pentru galactolipidele majore; PC și PE pentru fosfolipidele majore) și a lipidelor neutre (DAG și TAG) în culturi crescute fie în prezența, fie în absența Pi. ( E ) Raport 18: 1 și PUFA în glicerolipide mari (MGDG, DGDG, PC și PE) și lipide neutre (DAG și TAG) din culturi crescute fie în prezența, fie în absența Pi. Datele sunt mijloace ± SD a trei replici biologice pentru fiecare afecțiune. Diferențe statistice semnificative (P

Distribuție detaliată a FA PC și DGDG în Arabidopsis calli cultivate cu (+ Pi) sau fără (-Pi) fosfat ( A ) sau în culturi de suspensii de celule Arabidopsis care prezintă rate de creștere rapide sau lente ( B ). Datele sunt mijloace ± SD a trei replici biologice pentru fiecare afecțiune. Diferențe statistice semnificative (P

( A ) 18: 1 și PUFA (18: 2 + 18: 3) distribuție în celule cultivate timp de 80 de ore în mediu control sau în mediu fără Pi. ( B ) Determinarea qPCR a nivelurilor de expresie FAD în celulele crescute timp de 80 de ore fie în mediul de control, fie fără Pi. Rezultatele sunt exprimate ca modificări ale pliurilor față de condițiile de control inițiale. Datele sunt mijloace ± SD a trei replici biologice pentru fiecare afecțiune. Cu toate acestea, diferențele semnificative statistic (P 11. Rata de sinteză a lipidelor la soia este lentă în comparație cu alte plante oleaginoase 11 și situația poate diferi la alte plante. Când se ia în considerare întreaga plantă, situația poate diferi, de asemenea, de la un țesut la altul, în funcție de divizare În culturile celulare analizate aici, cantitatea de 18: 1 a scăzut pe măsură ce rata diviziunii a scăzut (vezi Fig. 1), indicând faptul că activitățile FAD în această stare nu au fost sau au fost limitative.

Aceste rezultate sugerează, de asemenea, că nivelul de nesaturare poate varia de la o cultură la alta, aceste variații rezultând din mici diferențe în ratele de creștere. Astfel, orice tratament care afectează rata de creștere sau divizare a celulelor ar putea afecta nivelul de nesaturare, atâta timp cât nu afectează rata de sinteză a lipidelor și/sau expresia sau reglarea FAD. La plantele superioare limitate la Pi, creșterea și producția de FA sunt puternic reduse 23. Restricția pi nu a afectat expresia genelor FAD2, FAD3, FAD6 și FAD7, iar factorii de corelație calculați între nivelul de nesaturare globală și rata de creștere au fost similari cu cei obținuți în condiții complete de creștere moderată (comparativ cu Figurile 2 și 3 ). Astfel, acest studiu sugerează că desaturarea lipidelor de către FAD2 și FAD3 în sisteme cu separare rapidă nu poate ajunge la o stare de echilibru și poate fi supusă variațiilor determinate de rata de creștere. Corelația in vivo dintre activitățile FAD2/FAD3 și rata proliferării celulare definește, de asemenea, nivelul PUFA ca o trăsătură caracteristică a maturității celulare și a îmbătrânirii la plante.

( A ) o curbă de corelație între 18: 2 și greutatea proaspătă a nămolului crescut în mediu lichid cu sau fără Pi. ( B ) la fel ca A, dar pentru 18: 3. Greutatea inițială proaspătă a fost de 1,5 ± 0,2 g pentru fiecare cultură și dezvoltarea biomasei a fost măsurată după 8 zile de creștere. ( C ) o curbă de corelație între 18: 2 și greutatea proaspătă a culturilor de suspensie celulară. ( D ) la fel ca C, dar pentru 18: 3. Biomasa a fost măsurată după 3 zile de cultură și greutatea inițială proaspătă la începutul experimentului a fost de 30 ± 5 mg/ml. Factorii de corelație R2 au fost calculați prin regresie liniară utilizând software-ul GraphPad Prism.

Imagine la dimensiune completă

metode

Culturi celulare

Celulele de pseudoplatină Acer au fost crescute ca culturi de suspensie în mediu așa cum s-a definit anterior32. Celulele au fost menținute ca o cultură de 250 ml pe un agitator rotativ vertical (125 rpm) la 22 ° C. Celulele au fost subculturate la fiecare 7 zile așa cum s-a descris mai sus. La fiecare moment, aproximativ 0,4 g de celule au fost colectate, filtrate pentru a îndepărta mediul, cântărite și congelate în azot lichid pentru analiza lipidelor.

Celulele Arabidopsis thaliana (ecotipul Columbia) au fost cultivate ca culturi în suspensie (200 ml) în mediu Murashige și Skoog (MSP09-50LT, Caisson Laboratories, Inc, SUA) fără fosfați (Pi) și suplimentate cu 1,5% (g/g).) v) zaharoză, 1,2 mg l-1 2, acid 4-diclorfenoxiacetic, fosfat de potasiu monohidrogen 50 mg l-1 și fosfat de potasiu dibazic 39 mg l-1. Culturile au fost menținute sub lumină continuă (100 μE m-2 s -1) la 22 ° C și agitate prin agitare rotativă la 125 rpm. Celulele au fost subculturate la fiecare 7 zile cu o densitate celulară inițială de 30 mg ml-1. La fiecare moment, aproximativ 0,5 g de celule au fost colectate, filtrate pentru a îndepărta mediul, cântărite și congelate în azot lichid pentru analiza lipidelor.

Calli Arabidopsis thaliana (ecotipul Columbia) a fost obținut din țesutul mezofil al frunzelor de două săptămâni ale rozetei Arabidopsis și crescut pe plăci de agar conținând mediu Murashige și Skoog (MSP09-50LT, Caisson Laboratories, Inc, SUA) suplimentat cu 3% (g/v).) zaharoză, 1,2 mg L-1 2, acid 4-diclorfenoxiacetic, fosfat de potasiu monohidrogen 50 mg l-1 și fosfat de potasiu dibazic 39 mg l-1. Pentru fiecare experiment, aproximativ 1,5 g de nămol a fost îndepărtat de pe placa de agar și suspendat în mediu lichid Murashige și Skoog cu sau fără Pi (Caisson Laboratories, Inc, SUA) suplimentat cu 1,5% (g/v) zaharoză și 1, 2 mg . 1-1 Acid 2,4-diclorfenoxiacetic. La fiecare moment, alicote au fost luate din culturile de suspensie de calus, filtrate pentru a îndepărta mediul, iar nămolul a fost cântărit și înghețat în azot lichid pentru analiza lipidelor.

Analiza lipidelor

Mai multe detalii

Cum se citează acest articol: Meï, C. și colab. Nivelurile de acizi grași polinesaturați se corelează cu rata de creștere în culturile de celule vegetale. Știință. reprezentant. 5, 15207; doi: 10, 1038/srep15207 (2015).

Comentarii

Prin trimiterea unui comentariu, sunteți de acord să respectați Termenii și condițiile și Regulile comunității. Dacă găsiți ceva jignitor sau nu respectați termenii sau liniile directoare, marcați-l ca fiind nepotrivit.