forma

  • obiecte
  • abstract
  • Principalul
  • Rezultatul
  • Formula expresă la kilometri distanță în timpul organogenezei zebrelor
  • Dereglare distanța una de cealaltă perturbă dezvoltarea celulelor părului și a foliculilor urechii
  • Dereglare distanțe afectează expresia genelor legate de auz la embrionii de pește zebră
  • Supraviețuirea celulelor de păr poate fi asociată cu funcția distanțe suprimare zBax2 și suport zMcl1b
  • discuţie
  • Materiale și metode
  • Declarație etică
  • Întreținerea și colectarea embrionilor
  • Sinteza MO și ARNm cu limită distanța una de cealaltă
  • microinjectii
  • Observarea veziculelor urechii
  • În esti aici hibridizare in situ
  • Colorarea celulelor de păr pentru a număra și detecta apoptoza/moartea
  • RT-PCR și qPCR
  • analize statistice
  • glosar

obiecte

  • apoptoza
  • Sistemul auditiv
  • Dezvoltarea sistemului nervos
  • genetică

abstract

Principalul

Pierderea auzului nu numai că dăunează sănătății fizice și mentale personale, dar crește și poverile sociale și economice. Afectarea auzului poate fi cauzată de o varietate de factori, inclusiv tulburări ale celulelor părului și ale structurilor urechii interne, dar țintele moleculare defecte rămân evazive. Identificarea noilor mecanisme moleculare asociate proceselor de dezvoltare a organelor auditive, cum ar fi migrația primordială neuromastică, formarea urechii interne, diferențierea și întreținerea celulelor de păr, precum și apoptoza celulelor de păr, vor contribui astfel la o mai bună înțelegere a pierderii auzului. patologie. Această dezvoltare a cunoștințelor va facilita dezvoltarea de noi medicamente pentru prevenirea ototoxicității și protecția auzului.

În acest studiu, am examinat funcțiile milei de pește zebră în dezvoltarea și supraviețuirea celulelor părului și neuromastilor și am raportat prima legătură între activitatea milei îndepărtate și dezvoltarea neuromastilor, celulelor părului și veziculelor urechii, precum și expresia genele auditive și familia genelor bcl-2. Concluzionăm că Mil poate fi un regulator important al formării și întreținerii organelor auditive în zebre. Descoperirile noastre vor contribui la o mai bună înțelegere a proceselor de dezvoltare a auzului și vor facilita cercetarea agenților otoprotectori.

Rezultatul

Model de expresie la kilometri distanță în timpul organogenezei zebrelor

Hibridizarea in situ de-a lungul monturii a fost utilizată pentru a detecta un model de expresie spațio-temporală îndepărtat unul de celălalt în timpul dezvoltării embrionare a peștilor zebră. Expresia îndepărtată de kilometri a fost agregată în principal în regiunea encefalică, în special la limita creierului mediu/creierului posterior și a creierului posterior ventral; iar expresia slabă a fost observată și la somite, dar nu și la notocorduri la 24 hpf (Figurile 1a, a 'și a' '). În faza faringiană (48 hpf), transcripția s-a concentrat la câțiva kilometri distanță de creierul mediu/creierul posterior, creierul mediu, creierul posterior ventral și tubul nervos și pardoselile vasculaturii au apărut în principal în modele regulate și discrete în poziții. viitori neuromasti pe liniile laterale (Figurile 1b, b 'și b' '). Cu toate acestea, în perioada de eclozionare (72 hpf), mRNA mile îndepărtate nu au fost detectate în liniile laterale și în placa posterioară a podelei, dar au fost încă extrem de exprimate la marginea creierului mijlociu/posterior, în trunchiul cerebral și placa de podea (Figura 1c ). ). Aceste rezultate sugerează că modelul de expresie aflat la câțiva kilometri distanță se corelează cu dezvoltarea sistemului nervos, inclusiv creierul, tubul nervos central și sistemul senzorial nervos din peștele zebră.

Model de expresie la kilometri distanță în timpul organogenezei într-o zebră. Hibridizarea in situ a fost efectuată cu o sondă ARN antisens la câțiva kilometri distanță în ( A ), ( b ) A ( c ); O sondă de simț a sensului la distanță de punct a fost utilizată ca sondă de control negativ ( d ). Secțiunile ventrale au fost selectate dintre embrioni pentru imagistica primară a capetelor și tulpinilor. Corpurile întregi au fost prezentate la 1 dpf ( A ), 2 dpf ( b ) și 3 dpf ( c ); titlurile relevante au fost arătate în ( A ') A ( b ') și tulpinile lor au fost prezentate în ( A '') A ( b ''). Săgețile negre indică pozițiile planificate ale neuromastelor pe liniile post-laterale din ( b ''). Parantezele negre au semnat marginea mijlocie/posterioară a chenarului în ( A ') A ( b '). În toate imaginile, capul este la stânga, coada la dreapta; partea din spate a picioarelor, partea inferioară a plăcii. Scara este de 310 μm în ( A ) A ( b ), 330 μm v ( c ), 380 μm v ( d ), 160 μm v ( A '), ( b '), 130 μm v ( A ''), 180 μm v ( b '')

Imagine la dimensiune completă

Nereglarea distanței între ele perturbă dezvoltarea celulelor de păr și a foliculilor urechii

Defecte de dezvoltare ale otolitilor și canalelor semicirculare cauzate de dereglare la distanță de kilometri. Embrionii au fost injectați cu 40 μM MOmil sau 40 ng/μl mil-mARN la una până la patru etape celulare și observați la 2 dpf ( A ) și 3 dpf ( b ). În comparație cu embrionii WT, au apărut forme neobișnuite de cobai la 2 dpf la morfani, cum ar fi urechile mărite și non-ovale (săgeți negre) și contracția sacilor (săgeți portocalii) prin injecție MOmil (9/10). Deși în grupul de control misMO, otolitii au o formă (12/13) similară cu cea a WT (10/10). Embrionii tratați prin injecție de ARNm la kilometri depărtare prezintă un sac deformat, divizat sau asemănător sincițiului (săgeți roșii) și utricule mai mici (săgeată neagră) prin injecție de ARNm la kilometri distanță (11/12). Istograma arată că variațiile dimensiunilor otolitelor cauzate de eliminarea genei sau supraexprimarea genei utilizând kilometri de suprafață otolitică, în care raportul dintre saccul și suprafața utriculului a fost folosit ca trăsătură. Compozițiile și SD sunt derivate din veziculele urechii specificate. ** Valori P

Expresia genică legată de auz a fost scăzută sau crescută în jos în larvele de pește zebră. Transcrierea genelor auditive asociate hmx2, fgf3, fgf8a, foxi1, otop1, pax2.1 și tmieb a fost examinată de RT-PCR în embrioni de 48 hpf și sa constatat că este dependentă de concentrație la morfanti (și c ) și a crescut în embrioni distanți milimetric injectați cu ARNm ( e A f ). Panourile superioare prezintă rezultate reprezentative ale electroforezei RT-PCR pentru MOmil ( A ) și ARNm injectat cu ARNm ( e ) și histogramele corespunzătoare din scanarea densității triplice RT-PCR au ca rezultat ( c A f) ). Grupul de control a fost simulat cu misMO injectat și a fost prezentat în ( b ) A ( d ). * Valori P

Apoptoza celulelor părului a fost indusă prin eliminare. Larvele de pește zebră la 6 dpf au fost colorate într-o soluție mixtă a celor trei coloranți timp de 30 de minute la 28 ° C, conform instrucțiunilor kitului. A ) Imagini ale neuromastului ml1 în larve injectate cu MOmil la 40 sau 500 μM și misMO 40 sau 500 μM separat comparativ cu neuromastul WT ml1. b ) histograma corespunzătoare pentru Figura 5a. ( c ) Imagini Neuromast O2 procesate în același mod ca neuromast ml1 MOmil și misMO, separat. d ) histograma corespunzătoare pentru Figura 5c. * Valori P

Cercetările anterioare au arătat că Mil era responsabil pentru controlul migrației și fuziunii celulelor precursoare cardiace în regiunea inimii și pentru diferențierea ulterioară într-un organ funcțional în dezvoltarea cardiovasculară. 5, 8, 24 În acest studiu, am constatat că funcția Mil poate fi parțial implicată în migrarea și dezvoltarea precursorilor celulelor de păr și a primodiilor pro-neuromastici în ALL și PLL (Figura 3). Conformitatea funcțională a Miles în organele divergente sugerează un rol comun fundamental al Mils în controlul migrației celulelor precursoare și a localizării acestora în organogeneza peștilor zebră.

Acest studiu oferă mai întâi dovezi că funcția genelor la distanță de kilometri depărtați este implicată în dezvoltarea veziculelor urechii și a liniilor celulare laterale ale părului și a neuromastilor din peștele zebră și că modificarea nivelurilor Mil poate regla expresia genei familiei bB-2 zBax2 și Mcl1B.,

Materiale și metode

Declarație etică

Acest studiu a fost realizat în strictă conformitate cu recomandările stabilite în Regulamentul de gestionare a animalelor de laborator din Ministerul Științei și Tehnologiei din China. Protocolul a fost aprobat de Comitetul pentru etica experimentelor pe animale de la Institutul de biotehnologie medicală, Academia Chineză de Științe Medicale (IMBF20060302).

Întreținerea și colectarea embrionilor

Tulpina Zebrafish (Danio rerio) WT Tuebingen a fost inițial obținută de la Universitatea de Științe ale Vieții, Universitatea din Beijing. Peștii au fost adăpostiți la 28,5 ± 1 ° C într-un ciclu de lumină-întuneric de 14/10 ore. 27 de embrioni au fost obținuți prin împerechere naturală; Embrionii sincroni corespunzători au fost colectați și înregistrați utilizând hpf și dpf 28. Embrionii au fost fixați cu 4% paraformaldehidă în soluție salină tamponată cu fosfat pentru hibridizare in situ sau imersați în reactivul Trizol (Invitrogen) pentru a izola ARNm. Pigmentarea la embrioni peste 24 hpf a fost prevenită prin incubația în feniltioureea (PTU) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, SUA) înainte de fixare.

Sinteza MO și ARNm cu distanță limitată una de cealaltă

Oligonucleotidele morfoline antisens MOmil și misMO au fost proiectate și achiziționate de la Genetools (Philomath, OR, SUA; //www.gene-tools.com). MOmil a fost utilizat pentru a inhiba traducerea la mile depărtare prin legarea la siturile de inițiere la mile depărtare cu secvența 5'-CCGCAAACAGACGGCAAGTAGTCAT-3 '. Controlul misMO 'a fost conceput pentru un control de injecție negativ în care cinci baze au fost pierdute și subliniate în secvența 5'-CCCCAAACACACCGCAACTACTCAT-3'. Ambele MO au fost redizolvate într-o soluție stoc de 1,0 μmol/ml în ddH 2 O.

Secvența CDNA distanțată pe tot parcursul unui kilometru a fost clonată din embrioni WT de 24 hpf prin reacție în lanț cu transcriptază inversă polimerază (RT-PCR) și grunduri proiectate în conformitate cu secvența de kilometraj zebră raportată de GenBank (NM_001159970) și identificată prin secvențiere (Sangon Biotech, Shanghai, China). Acest ADNc a fost folosit ca șablon pentru sinteza ARNm în buclă închisă folosind kitul Ambion mMESSAGE mMACHINE T3 (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA) și produsul a fost testat pentru calitate și randament prin electroforeză.

microinjectii

Pentru a colora celulele de păr, 1 nl de 20 μM MOmil sau 20 ng/μl de ARNm cu buclă închisă la una până la patru etape celulare a fost injectat separat în embrioni WT; cel puțin cinci larve la 6 dpf au fost utilizate pentru a număra celulele de păr ale neuromastelor o1, 02, ml1, ml2 și io4 și pentru a număra neuromastele pe liniile post-laterale. Pentru a observa larvele vii în urechi și pentru a număra celulele de păr, embrionii au fost injectați în aceeași etapă cu 1 nl de 20 μM MOmil sau 20 ng/μl de ARNm cu capac distanțat. Pentru a colora celulele părului prin apoptoză, 1 nl MOmil la 40 μM și 500 μM și misMO la aceleași concentrații au fost injectate în embrioni cu o singură celulă la patru celule; apoi larvele au fost colectate la 6 dpf. Pentru analiza RT-PCR a genelor asociate auzului, s-au injectat 1 nl de 10, 20 sau 40 μM MOmil și 10, 20 sau 40 ng/μl ARNm sigilat în mile. aceeași etapă embrionară. Embrionii au fost incubați și recoltați la 48 CPF. Pentru analiza qPCR a zBax2 și zMcl1b, 1 nl de 40 μM MOmil și 50 ng/μl de ARNm cu capac au fost injectate separat în aceeași fază embrionară. Embrionii au fost incubați în aceleași condiții ca mai sus.

Observarea veziculelor urechii

Morfologia și structura veziculelor urechii la embrionii Zebrafish injectați cu ARNm injectat în WT, MOmil și Mil la 48 și 72 hpf au fost observate sub un microscop de contrast diferențial IX71 (Olympus, Tokyo, Japonia) și înregistrate folosind o cameră digitală 500D ( Canon, Tokyo, Japonia). Fiecare grup are mai mult de 10 larve pentru numărarea otoliților și o histogramă.

Hibridizare in situ in situ

Pentru sinteza sondei ARN in vitro, o secvență genetică distanțată (kilometri) a fost inserată în pBluescript KS (Agilent, Santa Clara, CA, SUA), care a fost apoi folosit ca șablon pentru sinteza unei sonde ARN de sens și antisens folosind kilometri ai kitului de separare ARN DIG (Roche Applied Sciences, Basel, Elveția). Pentru a determina tiparele de expresie WT la kilometri distanță, embrionii au fost colectați la 24, 48 și 72 CPF. Embrionii tratați cu injecții de MOmil sau mARN, precum și controale WT, au fost colectați la 48 CPF. pentru a suprima pigmentarea înainte de fixare în paraformaldehidă 4% peste noapte la 4 ° C. Embrionii au fost tratați cu DNază înainte de hibridizare pentru a elimina interferența pseudo-pozitivă cauzată de ADN genomic. Următorii pași ai procedurii de hibridizare in situ in-mount au urmat protocolul standard. 29

Colorarea celulelor de păr pentru a număra și detecta apoptoza/moartea

Pentru numărarea celulelor de păr, larvele de pește zebră la 6 dpf au fost anesteziate în 0,016% tricaină (Sigma-Aldrich) și incubate în colorant fluorescent YO-PRO-1 (Invitrogen) la o concentrație finală de 1 μmol/L pentru colorarea celulelor de păr. nucleele 30 din cele cinci neuromaste, o1, ml1, ml2, o2 și io431, care erau situate pe suprafața veziculei urechii din jur. Larvele au fost apoi vizualizate folosind un microscop cu fluorescență în fază inversă IX51 (Olympus). Fiecare grup are cinci larve pentru colorarea și numărarea celulelor de păr. Fotografiile au fost făcute cu o cameră Canon 500D.

RT-PCR și qPCR

Tabel în dimensiune completă

analize statistice

Analizele statistice ale tuturor datelor (media ± SD) au fost efectuate folosind teste ANOVA unidirecționale, iar valorile P, 0,05 au fost marcate ca semnificative. Datele cu bare în histograme reprezintă medii și SD care sunt derivate din cel puțin trei exemple de realizare.