donatori

  • obiecte
  • abstract
  • Principalul
  • Rezultatul
  • MDD gestațional modifică proprietățile morfometrice și proprietățile creierului șobolanului
  • MDD reduce expresia creierului și fosforilarea Stat3
  • MDD afectează expresia protein kinazelor cheie active
  • Scăderea semnalizării Stat3 este asociată cu apoptoza crescută și expresia modificată concomitent a proteinelor înrudite in vivo aj in vitro
  • Scăderea semnalizării Stat3 este asociată cu o expresie crescută a miR-124 în creier
  • Tacerea miR-124 îmbunătățește semnalizarea Stat3 și cel puțin parțial salvează celulele expuse la deficit de folat
  • discuţie
  • Informatii suplimentare
  • Fișiere imagine
  • Figura suplimentară 1
  • Figura 2 suplimentară
  • Figura 3 suplimentară
  • Figura suplimentară 4
  • Documente Word
  • Legenda suplimentară a imaginii
  • glosar

obiecte

  • Semnalizare celulară
  • Dezvoltarea sistemului nervos
  • Metilarea ADN-ului
  • miARN

abstract

Principalul

În studiile experimentale, lipsa donatorilor de metil, cum ar fi folatul și B12, a fost asociată cu proliferarea/diferențierea celulelor neuronale dezechilibrate, stresul reticulului endoplasmatic și apoptoza. 11, 12, 13, 14, 15 În plus, la rozătoare au fost raportate atrofia hipocampului, raritatea microvasculaturii și afectarea cognitivă. 12, 16, 17 Deși s-a dovedit că homocisteina este embriotoxică, nu pare să fie direct responsabilă de tulburările de dezvoltare, 18, 19 și mecanismele care stau la baza efectului stării maternei de vitamina B asupra tubului neural și dezvoltarea creierului rămân prost inteles.

Dezvoltarea creierului embriofetal este un proces foarte complex care necesită exprimarea temporală a unor seturi de gene specifice cu un număr de pași organizați precis. 20 Pentru a determina modul în care reglarea genetică a factorilor de dezvoltare neuronală ar putea fi responsabilă pentru defectele cerebrale asociate cu epuizarea folatului/vitaminei B12, am folosit o abordare microarray (neurogeneză șobolan șobolan și celule stem neuronale PCR Array, RT 2 Profiler PCR Array, SABiosciences, Qiagen SA .). Deoarece traductorul de semnal și activatorul transcripției 3 (Stat3) au apărut ca o singură genă foarte redusă pentru deficiența vitaminei B, am investigat în continuare implicarea acestuia în consecințele MDD in vivo la un șobolan de șobolan progenitor hipocampic 12, 17 și in vitro validat model. 14

Stat3, în primul rând asociat cu semnale legate de citokine și factori de creștere, este activat prin fosforilare și reglează transcrierea genelor țintă care sunt implicate în multe răspunsuri fiziologice. Într-adevăr, Stat3 a fost implicat în mod repetat în procesele biologice de bază, cum ar fi proliferarea celulară, diferențierea, apoptoza și supraviețuirea, 22, 23 și s-a dovedit a fi implicat în diferite evenimente de dezvoltare, cum ar fi legarea și conducerea neuronilor motori 24 și dezvoltarea neuritei. Iată primele dovezi că MDD timpuriu provoacă o pierdere a semnalizării Stat3 asociată cu supraexprimarea miR-124, cu afectarea dezvoltării creierului.

Rezultatul

Studiile anterioare in vivo și in vitro au demonstrat eficacitatea condițiilor noastre experimentale în reducerea disponibilității donatorului de metil la descendenții șobolanilor 12, 26 și în celulele H19-7 ale hipocampului. 14 În ambele modele experimentale, metilarea globală a ADN-ului a fost redusă în condițiile experimentului cu alcool metilic scăzut, adică cu 23,2% în țesutul cerebral fetal (n = 4) și cu 40,4% în celulele hipocampice cultivate la 13 ore după inducerea diferențierii lor ( n = 4).

MDD gestațional modifică proprietățile morfometrice și proprietățile creierului șobolanului

Așa cum se arată în Figura 1, greutatea corporală și lungimea corpului au fost reduse semnificativ (-20,5% și -15%) în timpul sarcinii târzii (ziua embrionară 20, E20) la șobolanii fetali hrăniți cu diete, după cum se indică prin apariția creșterii retardului intrauterin. Acest lucru a fost confirmat de o reducere semnificativă a lungimii femurului (-14%). În timp ce greutatea creierului a fost de asemenea afectată (-14,6%), grosimea straturilor cerebrale selective, cum ar fi stratul piramidal hipocampic CA1, stratul celular al granulei girus dentare și zona subventriculară neurogenă (-40, -22% și -26 %). Cel mai interesant este însă că aceste zone ale creierului au rămas atrofiate la vârsta de 450 de zile, deși puii de șobolan au primit doar o dietă standard, deficitară de la înțărcare (Figurile 1e-h).

Efectele deficienței donatorului de metil asupra proprietăților morfometrice ale fătului de șobolan. anunț ) Măsurători morfometrice generale la fetuții martor și MDD în ziua embrionului (DE) 20, 33≤ n ≤37. Datele sunt prezentate ca media ± SD Diferențe semnificative statistic între șobolanii martor și MDD: ** P 705 și fosfo-Stat3 Ser 727 (Figura 2b). Modificările cantitative ale nivelurilor de proteine ​​sunt prezentate în informațiile suplimentare (Figura 1 suplimentară). Conform analizelor noastre Western blot, cantitatea totală de proteină Stat3 a fost redusă cu 62% în creierul mediu lipsit de făt. Așa cum se arată în Figura 2c pentru fosfo-Stat3 Tyr 705, astfel de observații au fost confirmate prin imunohistochimie in situ în cortexul cerebral, în SVZ și în stratul CA1 al hipocampului.

Efectele deficitului de donator de metil asupra expresiei cerebrale a Stat3 și fosfo-Stat3 (Tyr 705 și Ser 727) la fetușii de șobolan la E20. A ) Niveluri totale de ARNm Stat3 măsurate prin RT-PCR cantitativă în timp real. Datele sunt raportate în unități arbitrare (AU) ca medie ± SD (n = 5), * P 705 și fosfo-Stat3 Ser 727 în creier mediu și cortex de la fetuții martor (C) și MDD E20. Profiluri similare au fost obținute din alte cinci experimente. c ) Colorarea imunohistochimică a Stat3 și fosfo-Stat3 Tyr 705 în cortexul cerebral, SVZ și stratul hipocampic al CA1 de la fetuții martor și MDD E20

Imagine la dimensiune completă

Rezultate similare au fost obținute în celule progenitoare hipocampice cultivate cu niveluri reduse de ARNm (-54%) și expresie proteică la 6 și 13 ore după inducerea diferențierii în celule fără folat (Figura 3 și Figura Adițională 1). Cantitatea de proteină Stat3 totală a scăzut cu 48% la 13 ore după inducerea diferențierii celulare. În plus, analizele imunocitochimice prin microscopie confocală au relevat o scădere aparentă a prezenței Stat3 în nucleele celulare (Figura 3c).

Efectele deficitului de acid folic asupra expresiei Stat3 și fosfo-Stat3 (Tyr 705 și Ser 727) în celulele progenitoare ale hipocampului H19-7. A ) Niveluri totale de ARNm Stat3 măsurate prin RT-PCR cantitativă în timp real în celulele martor și cu deficit de B9 la 13 ore după inducerea diferențierii lor. Datele sunt raportate în AU ca medie ± SD (n = 5), * P 705 și fosfo-Stat3 Ser 727 în celulele martor (C) și cu deficit de B9 (D) H19-7 la 6 și 13 ore după inducerea diferențierii. au fost obținute din alte cinci experimente. c ) Etichetarea imunocitochimică a Stat3, phospho-Stat3 Tyr 705 și phospho-Stat3 Ser 727 în celule de control cu ​​deficit de B9 și celule H19-7 la 13 ore după inducerea diferențierii lor

Imagine la dimensiune completă

MDD afectează expresia protein kinazelor cheie active

Căile de semnalizare Stat3 necesită mai multe kinaze, cum ar fi kinazele MAP Erk1/2, p38, kinaza N-terminală c-Jun (JNK) și Src, care sunt implicate în dimerizarea și activarea Stat3. 27, 28

După expunerea la MDD, modelele de expresie ale formelor active fosforilate ale kinazelor corespunzătoare au fost afectate în mod diferit (Figura 4). Nivelurile de expresie ale phopho-Erk1/2, phospho-Src și phospho-p38 au scăzut semnificativ, în timp ce expresia phospho-JNK a crescut, iar expresia phospho-Akt nu s-a modificat semnificativ. Important, profilurile înregistrate au fost similare în țesutul cerebral fetal și în diferențierea celulelor H19-7. Modificările cantitative ale cantității de proteine ​​sunt date în informațiile suplimentare (figura suplimentară 2).

Analiza Western blot a fosfo-kinazelor din amonte implicate în căile de semnalizare Stat3 în cortexul cerebral al fetusilor martor (C) și MDD E20 și în celulele martor (C) și cu deficit de B9 (D) H19-7 la 6 și 13 ore după inducție a diferențierii lor. Profiluri similare au fost obținute din alte cinci experimente

Imagine la dimensiune completă

Scăderea semnalizării Stat3 este asociată cu apoptoza crescută și expresia modificată concomitent a proteinelor înrudite in vivo și in vitro

Se știe că activarea Stat3 afectează pozitiv expresia antiapoptotică și a proteinelor de supraviețuire Bcl-2 și Bcl-xL. 29, 30 Prin urmare, am examinat nivelurile lor de expresie, precum și nivelurile altor factori cheie în apoptoză după MDD.

Așa cum era de așteptat, cantitatea de Bcl-2 și Bcl-xL a scăzut semnificativ în creierul fetușilor E20 hrăniți cu o dietă slabă, în timp ce nivelurile de expresie ale proteinelor proapoptotice Bax și caspaza-3 scindate au crescut atât în ​​creier, cât și în creier. cortex, caspaza-9 scindată este supraexprimată numai în mijlocul creierului (Figura 5a). Modificările cantitative ale cantității de proteine ​​sunt date în informațiile suplimentare (Figura 2 suplimentară). În plus, numărul de celule TUNEL-pozitive din hipocampus, SVZ și cortexul cerebral al fetusilor deficienți a crescut semnificativ (Figura 5c, Figura Adițională 3). Acest lucru a fost confirmat prin marcarea caspazei-3 active și a caspazei-9 în creierul fetal, așa cum se arată în regiunea hipocampică a CA1 și în SVZ, cu prezența unui număr mare de celule moarte în ventriculul lateral (Figura suplimentară 3 ).,

Într-un studiu care utilizează TaqMan RT-qPCR, modelele de expresie miR-124a ncARN au arătat o creștere semnificativă (de două ori) în creierul fetușilor E20 expuși la MDD, precum și la neuroprogenii H19-7 cu deficit de B9 la 13 ore după inducție. diferențierea lor (1,7 ori) (Figurile 6a). Acest lucru a fost confirmat de hibridizarea in situ in vivo în diferite regiuni ale creierului, inclusiv hipocampul, SVZ (Figura 6c) și cerebel (neprezentat) și in vitro în celulele de diferențiere (Figura 6d).

Efectele deficitului de donator de metil asupra expresiei miR-124. A ) Nivelurile de expresie ale miR-124 în AU în creierul controlului și fetușii deficienți în E20. ( b ) Niveluri de expresie în celulele martor (C) și cu deficit de B9 (D) H19-7 la 13 ore după inducerea diferențierii lor. Toate datele sunt raportate ca media ± SD (n = 9 și n = 7 pentru țesutul cerebral E20 și celulele cultivate H19-7), * P ** P

Efectele silențierii miR-124 asupra diferențierii celulare H19-7. ( A ) Efectele miR-124 siRNA asupra nivelurilor de expresie ale Stat3 și proteinelor înrudite în celulele martor (C) și deficiente de folat (D) la 13 ore după inducerea diferențierii (si = siRNA ne-țintit, siM = siRNA țintit miR-124) . Modelele de expresie sunt reprezentative pentru trei serii separate de western blot. ( b ) Efectul miR-124 siRNA asupra morfologiei celulare la 13 ore după inducerea diferențierii. ( c ) Procentul de celule apoptotice așa cum se arată în testul TUNEL. d ) Numărul de procese celulare per celulă. Pentru ( c ) A ( d ): diferență semnificativă statistic cu un control adecvat: * P •• P 14 În acest studiu, reglarea descendentă a miR-124 siARN a dus la o reluare marcată a acestor procese. Deși tratamentul cu miR-124 siARN a afectat ușor caracteristicile celulelor la progenitorii martori, numărul de neurite per celulă a fost de ∼-ori crescut în celulele cu deficit de folat, tratate cu miR-124 siARN, comparativ cu celulele tratate cu siARN neintenționat (Figurile 7d, P

Rezumatul evenimentelor majore legate de consecințele MDD în creierul șobolanului. Vă rugăm să rețineți că oferim primele dovezi ale reducerii regulii de către miR-124 pentru activitatea Src, care reprezintă fosforilarea Stat3 la reziduul Tyr 705.

Imagine la dimensiune completă

Efectele directe ale MDD asupra metabolismului unic al carbonului și diferiții săi factori cheie într-un model animal, precum și efectele deficitului de acid folic asupra progenitorilor de hipocampal H19-7 cultivate au fost descrise în detaliu în rapoartele anterioare. 12, 14, 26 Un astfel de tratament are ca rezultat în special acumularea de homocisteină și o reducere a indicelui celular al capacității de metilare corespunzătoare raportului SAM/SAH. Acest lucru se reflectă în studiul nostru, în special în reducerea cantității de ADN metilat ca răspuns la MDD în cele două modele experimentale ale noastre.

În mod surprinzător, în timp ce tratamentul cu siR miR-124a siRNA a redus ușor numărul de neurite din celulele de control, a îmbunătățit semnificativ morfologia celulară la progenitori deficienți.

Deși mecanismele exacte prin care starea vitaminei B poate afecta expresia miR-124 sunt încă pe deplin elucidate, existența unei legături între folat și miR a fost documentată anterior. Suplimentarea cu folat ar avea un efect benefic asupra teratogenezei induse de etanol în creierul fetal prin reducerea parțială a reglării miR-10a, 43 în timp ce exprimarea diferitelor miR în creierul în curs de dezvoltare al modelului mutant de șoarece al tubului neural (Splotch -/) a fost modificată prin suplimentarea cu acid folic. 44 În cele din urmă, Marsit și colab. 45 a arătat că deficiența de folat a determinat o creștere semnificativă a profilurilor de expresie a mai multor miR în celulele limfoblastoidiene umane cultivate. Scăderea statutului acidului folic/vitamina B12 duce la reducerea disponibilității SAM, care este necesară pentru reacțiile de metilare celulară. MiR-urile au fost documentate ca fiind reglate de evenimente epigenetice, iar tăcerea mediată de metilare a genelor miR-124 a fost demonstrată recent. 47 Prin urmare, expresia modificată a miR-124 poate fi asociată cu o cantitate redusă de donatori de grup metil, împreună cu metilarea redusă a ADN-ului, așa cum sa observat în modelele noastre, și, în cele din urmă, poate duce la modificări ale expresiei Stat3.

În concluzie, am arătat că MDD a fost asociată cu o expresie crescută a miR-124, care a afectat semnalizarea Stat3 la două niveluri diferite; mai întâi la nivelul de expresie prin țintirea mARN-ului Stat3 și al doilea prin țintirea activării acestuia prin inhibarea kinazelor Erk1/2 și Src, fără efectele miR-124 asupra altor kinaze implicate în semnalizarea Stat3. Creierul este foarte vulnerabil în timpul dezvoltării și afectarea semnalizării Stat3 poate duce la o proliferare celulară redusă și la apoptoză crescută, ceea ce poate duce la atrofierea definitivă a straturilor cerebrale specifice, așa cum se observă la șobolanii cu deficit de vitamina B.