recombinază

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Rezultatul
  • Efectul suicid al diferitelor proteine ​​de fuziune TK
  • Integrare genomică specifică sitului în celulele HEK293 mediată de integraza phiC31
  • Integrarea specifică site-ului și excizia recombinazelor în fibroblastele fetale bovine primare izolate
  • discuţie
  • metode
  • Declarație etică
  • Construct de plasmidă
  • Cultura celulară și transfecție
  • Western blot
  • Test de citotoxicitate
  • Analiza citometriei de flux
  • Prepararea proteinei permeabile la celule recombinate și a transducției proteinelor
  • Southern blot
  • analize statistice
  • Informatii suplimentare
  • Fișiere PDF
  • Informatii suplimentare
  • Fișiere imagine
  • Informatii suplimentare
  • Informatii suplimentare
  • Informatii suplimentare
  • Comentarii

obiecte

  • Genetica agricolă
  • Inginerie genetică
  • Vectorii genetici

abstract

Livrarea genei mediate de integraza PhiC31 este utilizată pe scară largă în terapia genetică animală și transgeneză. Cu toate acestea, evenimentele de integrare aleatorie sunt observate la integrarea mediată de phiC31 în diferite tipuri de celule de mamifere; ca urmare, eficacitatea integrării site-ului pseudo attP și evaluarea integrării site-specific este compromisă. Pentru a îmbunătăți acest sistem, am folosit gena de fuziune attB-TK ca un marker de selecție negativ, eliminând integrarea aleatorie în timpul transfecției mediată de phiC31. De asemenea, am selectat un sistem de selecție și o coloană vertebrală bacteriană plasmidică folosind alte două recombinaze specifice site-ului, Cre și Dre. Astfel, am generat celule de fibroblast fetal bovine transgenice pure fără marker de selecție și plasmidă dintr-o coloană vertebrală bacteriană. Aceste celule pure au fost utilizate ca nuclee donatoare pentru transferul nuclear al celulelor somatice (SCNT), sugerând o competență de dezvoltare similară a embrionilor SCNT ca celulele non-transgenice. Prin urmare, actualul sistem de livrare a genelor a facilitat dezvoltarea terapiei genetice și a biotehnologiei agricole.

Integraza PhiC31 este o recombinază ADN derivată din fagul Streptomyces φ C31 1. Această enzimă poate media recombinarea între două secvențe, attB și attP 2, 3. Integraza PhiC31 nu necesită conservarea perfectă a sitului attP pentru a realiza recombinarea între siturile attP și attB 4. Aceste situsuri imperfecte attP sau pseudo-situri attP seamănă cu situsul 5 de tip sălbatic attP și sunt prezente în regiunile active transcripțional ale genomului 6. Integraza PhiC31 recunoaște secvențe relativ scurte, dar ușor specifice în genomii de mamifere 7. Astfel, sistemul integrază phiC31 prezintă mai multe caracteristici, cum ar fi specificitatea locală și recombinarea unidirecțională, și permite utilizarea cu succes a integrazei în diferite domenii de studiu, inclusiv livrarea in vitro a genelor 5 sau in vivo 8, terapia genică 9 și producția de animale transgenice 10. .

Am prezentat o abordare care a folosit o strategie de selecție negativă pentru a exclude integrarea aleatorie în timpul transfecției mediată de phiC31. De asemenea, am selectat un sistem de selecție și o coloană vertebrală bacteriană plasmidică folosind alte două recombinaze, și anume Cre și Dre.

Rezultatul

Efectul suicid al diferitelor proteine ​​de fuziune TK

(A) Schema diferitelor construcții FT traduse. CMV: citomegalovirus imediat promotor timpuriu; loxP și rox: ținte de recunoaștere a recombinazelor Cre și Dre; attB35 și attBwt: dimensiunea fracțională minimă și lungimea totală a sitului attB de tip sălbatic; G4S × 3: (Gly 4 Ser) 3 linker flexibil; P2A: peptidă 2A auto-clivabilă derivată din teschovirus-1 porcin; ATG: codon de inițiere flancat de secvența convențională Kozak; control: vector gol pIRES2-AcGFP1-Nuc. (B) Analiza Western blot a celulelor HEK293 transfectate cu diferite constructe TK. Blotul a fost testat cu anticorpi policlonali împotriva HSV-1 TK sau GAPDH. Stelele indică produse de degradare proteolitică probabile. Blocurile de lungime completă sunt prezentate în figura suplimentară S8. (C) Colorarea imunofluorescentă a celulelor HEK293 la 48 de ore după transfecție. Nucleele au fost colorate cu DAPI (albastru); Proteinele TK (roșii) au fost colorate cu anticorp anti-TK și vizualizate cu anticorpi secundari marcați Cy3. Scara scalei = 10 μm. (D) Viabilitatea relativă a celulelor HEK293 transfectate cu diferite constructe TK. Celulele transfectate selectate de FACS au fost expuse la diferite concentrații ale analogului nucleozidic GCV timp de 4 zile. Citotoxicitatea a fost determinată utilizând testul WST-1. „Control” reprezintă celulele transfectate cu vectorul gol pIRES2-AcGFP1-Nuc.

Imagine la dimensiune completă

Un test de citotoxicitate a fost efectuat pe celulele HEK293 pentru a investiga efectul suicid al diferitelor proteine ​​de fuziune TK. Rezultatele au arătat că toate constructele TK, cu excepția celulelor HEK293 transfectate de control, au fost sensibile la tratamentul cu ganciclovir (GCV) la concentrații mari (Figura 1D). În contrast, linia celulară de control vector transfectată cu pIRES2-AcGFP1-Nuc a fost foarte rezistentă la 10 ug/ml GCV și a prezentat 2,76% moarte celulară. La 0,1 μg/ml GCV, 51,1 ± 4,0% din celule erau moarte în grupul transfectat attBrP2ATK comparativ cu 28,5 ± 7,7% (P = 0,001) și 34,8 ± 4,5% (P = 0,032) mortalitate celulară în attBrTK- și attBrG4STK. - celule transfectate după o perioadă de tratament de 4 zile. Acest rezultat a indicat faptul că celulele transfectate cu attBrP2ATK au fost mai sensibile la GCV decât celelalte două celule transfectate cu constructul TK fuzionat la attB la concentrații relativ mici de GCV. În comparație, celulele transfectate cu attBrP2ATK au prezentat o viabilitate similară cu celulele transfectate cu attB35TK și wt-TK, în care proteina de tip sălbatic a fost exprimată în ambele grupuri. Prin urmare, am ales attBrP2ATK ca un construct TK reprezentativ fuzionat la attB de lungime completă pentru următoarele studii.

Integrarea genomică specifică site-ului în celulele HEK293 mediată de integraza phiC31

Tabel în dimensiune completă

Tabel în dimensiune completă

Integrarea și excizia site-specific a recombinazelor în fibroblastele fetale bovine izolate primare

Promotorul CMV a fost înlocuit cu promotorul CAGGS pentru a menține niveluri ridicate de exprimare a transgenelor TK. Rezultatul a fost crearea vectorului de integrare a plasmidei pCAG-attBrP2ATK (Figura 2A). Am adăugat, de asemenea, un site de clonare multiplă (MCS) flancat rox și loxP pentru a introduce genele dorite (GOI), apoi am înlocuit caseta IRES-AcGFP-Nuc cu o casetă care exprimă EGFP acționată de promotorul EF1α. Pentru a determina eficiența expresiei noului vector de integrare generat, am transfectat celulele HEK293 tranzitoriu folosind constructele TK conduse fie de promotorul CMV, fie de promotorul CAGG. Testul Western blot a arătat că produsul TK a fost puternic exprimat în cadrul promotorului CAGGS (Figura suplimentară S2A). Celulele au fost observate prin microscopie cu fluorescență la 48 de ore după transfecție. Celulele HEK293 transfectate pCAG-attBrP2ATK au prezentat un semnal GFP fluorescent puternic (Figura suplimentară S2B). Acest rezultat a sugerat o funcție adecvată pentru promotorul EF1a. Prin urmare, pCAG-attBrP2ATK a fost utilizat în alte experimente, care au dus probabil la o expresie puternică a transgenului în celulele izolate primare.

Imagine la dimensiune completă

Un port sigur unic de celule transgenice pure integrate fără markeri de selecție și coloana vertebrală excizată au fost folosiți ca donatori nucleari pentru a produce embrioni transgenici SCNT. În plus, fibroblastele fetale bovine normale derivate de la același făt și cu un număr similar de pasaj au fost utilizate ca control pentru a investiga efectul procedurilor transgenice asupra potențialului de dezvoltare al embrionilor SCNT. Când celulele excizate au fost utilizate ca donatori nucleari comparativ cu celulele fibroblaste bovine fetale bovine netransfectate, nu au fost observate diferențe semnificative în rata de scindare și formarea blastocistului (77, 4 ± 2,6% față de 78,6 ± 4,3%, P = 0,7 la rata de scindare, 32,6 ± 2,9% vs 36,3 ± 4,0%, P = 0,3 pentru rata de formare a blastocistului). Au fost observate și rate similare de sarcină după transferul embrionului, comparativ cu grupul martor (25,9 ± 2,4% față de 32,3 ± 4,7%, P = 0,1).

discuţie

Am introdus o nouă strategie care poate fi utilizată pentru a selecta integrarea pseudo-specifică mediată de phiC31 din integrarea aleatorie și pentru a produce celule transgenice pure fără markeri de selecție și coloană vertebrală vectorială. Am folosit integraza phiC31 pentru a realiza integrarea genomică specifică site-ului în pseudo-site-uri. De asemenea, am folosit proteine ​​de fuziune attB-TK ca markeri de selecție negativi pentru a exclude integrarea aleatorie. Celulele transgenice pure au fost obținute prin sortarea celulelor activate prin fluorescență după tratamentul cu Cre- și Dre-recombinază.

În cele din urmă, acest studiu prezintă o strategie simplă mediată de phiC31 pentru integrarea transgenului într-un port genomic sigur, prevenind integrarea aleatorie și combinând transducția proteinelor permeabile la celule și sortarea celulelor activate de fluorescență pentru a elimina sistemul de selecție și coloana vertebrală. Această abordare non-virală oferă o alternativă simplă și sigură pentru producerea de celule transgenice pure fără markeri de selecție și o coloană vertebrală bacteriană plasmidică. Prin urmare, strategia noastră este un instrument valoros în terapia genică și transgeneză la animale.

metode

Declarație etică

Procedura experimentală a fost aprobată de Comisia pentru îngrijirea animalelor de la Colegiul de Medicină Veterinară de la Universitatea Northwestern A&F din China. Ouăle de bovine de la vaci mature sacrificate au fost colectate de la abatorul Tumen (Xi'An, China). Femelele Holstein nou-născuți au fost utilizate pentru obținerea culturilor de celule de donatori nucleari, iar vacile bovine Angus (Yangling Keyuan Cloning Co., Ltd., PR China) au fost folosite ca animale plăcute.

Construct de plasmidă

Mai multe construcții de fuziune TK au fost generate așa cum este descris în MATERIALE ȘI METODE ADIȚIONALE (Figura 1A). Secvențele primare, site-urile de restricție și șabloanele utilizate în studiu sunt listate în Tabelul SI.

Cultura celulară și transfecție

Celulele HEK293 au fost cultivate în mediul Eagle modificat de Dulbecco (DMEM; GIBCO, Carlsbad, CA) suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS; GIBCO) la 37 ° C într-o atmosferă umidificată cu 5% CO 2. Fibroblastele fetale bovine au fost izolate de la un făt Holstein (50-60 de zile; Yangling Keyuan Biotechnology Inc., China) prin dezagregarea corpului fără cap și a măruntaielor; fibroblastele au fost apoi cultivate în DMEM suplimentat cu 10% FBS la 38,5 ° C într-o atmosferă umidificată cu 5% CO2. Fibroblastele fetale bovine la confluență au fost colectate prin tripsinizare și supuse trecerii sau crioconservării.

Transfecția celulară a fost efectuată așa cum sa descris anterior 20. Pe scurt, celulele HEK293 sau fibroblastele fetale bovine au fost resuspendate în 0,2 ml de tampon de lucru diluat pentru electroporare conținând doar plasmidă donatoare (5 μg) sau plasmidă donatoare (5 μg) cu mRNA phiC31 (1 μg). Electroporarea a fost efectuată folosind BTX ECM2001 (BTX, San Diego, CA) setat pentru un impuls de 2 ms la 510 V. La 24 de ore după electroporare, celulele au fost diluate într-un vas de 10 cm conținând mediu proaspăt suplimentat cu G418 (400 μg)/ml 600 μg./Ml) sau G418/GCV (400 μg/ml la 600 μg/ml și 1 μg/ml la 10 μg/ml) pentru selectarea celulelor transfectate stabil. Selecția a fost efectuată timp de 12 până la 15 zile până când coloniile individuale au fost colectate și numărate.

Western blot

Expresia proteinei timidin kinazei a fost detectată prin western blot. Lizatele celulare au fost preparate din celule HEK293 transfectate cu martor vector gol (pIRES2-AcGFP1-Nuc) sau diverse construcții TK (attB35TK, attBrTK, attBrG4STK, attBrP2ATK și wt-TK). La 48 de ore după transfecție, celulele au fost recoltate și resuspendate în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS). Proteina totală (10 μg) a fost încărcată pe o singură bandă pe un gel SDS-PAGE de 12%. Gelul a fost transferat pe membrane de fluorură de poliviniliden (Millipore, Billerica, MA) și supus analizei Western blot conform protocolului standard. Anticorp policlonal de capră împotriva HSV-1 timidin kinazei (1: 1000; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) și IgG anti-Goat Donkey (H + L; 1: 1000; Beyotime, Jiangsu, China). au fost utilizate pentru a detecta produsele TK. Pentru detectarea GAPDH a fost utilizat un anticorp policonal de iepure împotriva GAPDH (1: 1000, Sigma) și IgG de capră anti-iepure marcat cu HRP (H + L; 1: 1000; Beyotime).

Test de citotoxicitate

Celulele HEK293 au fost transfectate cu diferite construcții TK în absența integrazei phiC31. Celulele transfectate au fost determinate prin expresia GFP și sortate după FACS efectuate la 48 de ore după transfecție. Celulele GFP pozitive sortate au fost însămânțate în plăci cu 96 de godeuri la o densitate celulară de 5,0 × 103 celule/godeu. Concentrațiile GCV (0, 0,01, 0,1, 1, 10 și 20 μg/ml) au fost adăugate la celulele transfectate. După 4 zile, efectul uciderii GCV a fost măsurat folosind un kit de testare a proliferării și citotoxicității celulare WST-1 (Beyotime) conform instrucțiunilor producătorului.

Analiza citometriei de flux

La 2 sau 5 zile după transfecție, 2 × 107 celule din fiecare cultură transfectate numai cu constructe de fuziune TK sau constructe de fuziune TK și ARNm phiC31 au fost recoltate prin tripsinizare și resuspendate în PBS conținând 2% FBS. Celulele au fost apoi analizate prin citometrie în flux pentru a determina expresia GFP. Analiza citometrică de flux a fost efectuată folosind BD FACSAria (BD Biosciences, San Jose, CA).

Prepararea proteinei permeabile la celule recombinate și a transducției proteinelor

pET-28a (+) - Plasmidele His-TAT-Dre-NLS au fost construite prin donarea secvenței TAT-Dre-NLS în vectorul de expresie His6 pET-28a (+). Vectorul de expresie pET-28a (+) - His-NLS-TAT-Cre 20 și pET-28a (+) - His-TAT-Dre-NLS au fost utilizate pentru a transforma tulpina Escherichia coli BL21 (DE3) separat pentru expresia inductibilă IPTG a proteinelor Cre și Dre marcate cu His. Exprimarea și purificarea proteinelor Cre și Dre marcate cu His au fost efectuate în conformitate cu protocolul detaliat descris anterior 20. Concentrațiile de proteine ​​au fost măsurate folosind un kit de testare a proteinei BCA (Beyotime). Pentru experimentele de transducție a proteinelor, 2 × 106 celule au fost însămânțate pe o placă cu 24 de godeuri și crescute timp de 24 de ore. Proteinele permeante celulare au fost sterilizate prin filtrare folosind un filtru de 0,22 μm (Millipore). Celulele au fost incubate timp de 4 ore într-un mediu conținând 100 μg/ml de His-NLS-TAT-Cre și 100 μg/ml de proteine ​​His-TAT-Dre-NLS. După transducție, celulele au fost spălate cu PBS și cultivate pentru încă 72 de ore într-un mediu normal înainte de efectuarea analizei citometrice în flux.

Southern blot

Aproximativ 10 μg la 20 μg de ADN genomic din celule netransfectate sau colonii de celule transfectate stabil a fost digerat cu BamHI și HindIII (New England Biolabs, Beijing, China) peste noapte și rezolvat prin electroforeză pe gel de agaroză. ADN-ul a fost transferat, supus unei legături încrucișate UV pe o membrană de nailon Hybond N + (Roche, South San Francisco, CA) și hibridizat cu o sondă TK sau o neo-sondă generată folosind un kit de pornire DIG High Prime Labeling și Detection II (Roche). Secvențele primare au fost listate după cum urmează: pentru sonda TK, 5'-CAGCAAGAAGCCACGGAAGT-3 '(înainte) și 5'-GCCCGAAACAGGGTAAATAACG-3' (invers); pentru neo-sondă, 5′-GGATTGCACGCAGGTTCTCCG-3 ′ (înainte) și 5′-CGCCGCCAAGCTCTTCAGCAA-3 ′ (invers).

analize statistice

Fiecare experiment a fost efectuat de cel puțin 3 ori. Datele au fost analizate folosind SPSS 20.0 (IBM Corporation, Somers, NY, SUA) cu ANOVA unidirecțional și teste de diferență cel mai puțin semnificative. Datele au fost raportate ca medie ± SEM. P