obiecte
abstract
Complexul mitocondrial izolat IV (citocrom c oxidază) este o cauză importantă a bolii mitocondriale la copii și adulți. Este eterogen din punct de vedere genetic, deoarece atât produsele genetice codificate mtDNA, cât și cele codificate nuclear contribuie la componentele structurale și factorii de asamblare. Variantele patogene din cadrul acestor proteine sunt asociate cu variabilitatea clinică, de la implicarea organelor izolate până la prezentarea bolilor multisistemice. Au fost descrise defecte ale mai mult de 10 factori complexi IV, inclusiv o mutație recentă a fondatorului libanez în PET100 la pacienții cu sindrom Leigh. Prezentăm o examinare clinică și moleculară a unui pacient cu debut fatal, neonatal, al unui deficit izolat de complex IV asociat cu implicarea multiorganică, care sa născut într-o familie de familii asiatice britanice din prima familie. Secvențierea exomomului a dezvăluit o variantă de trunchiere homozigotă (c.142C> T, p. (Gln48 *)) în gena PET100, ceea ce are ca rezultat pierderea completă a activității enzimei și asamblarea holocomplexă. Raportul nostru confirmă mutația PET100 ca fiind o cauză importantă a deficitului izolat de complex IV în afara populației libaneze, lărgind spectrul fenotipic asociat cu anomalii ale acestei gene.
Fosforilarea oxidativă mitocondrială (OXPHOS) este calea principală pentru producerea de adenozin trifosfat (ATP) în celulele eucariote. Acest sistem OXPHOS conține cinci complexe transmembranare (I-V), care constau din
Aici, raportăm aplicarea secvențierii exomului întreg pentru a elucida baza deficitului de COX izolat la un pacient pediatric cu prezentare neonatală severă și fatală a bolii mitocondriale datorită unei variante homozigote a trunchierii în gena PET100. Studiile anterioare pe drojdie au identificat gena PET100 ca un factor în biogeneza COX, 21, 22, 23, iar o mutație libaneză mai recentă în fondatorul PET100 a fost descrisă la 10 persoane cu sindrom Leigh. Fibroblastele și mușchii scheletici la pacientul nostru au prezentat o activitate complexă IV afectată, asociată cu o tulburare profundă în asamblarea COX și niveluri reduse la starea de echilibru a proteinelor IV complexe. Aceste date oferă dovezi suplimentare că PET100 este un factor esențial implicat în maturarea și asamblarea complexului IV.
Subiecte și metode
Pacientul 1
Pacienta noastră (ID 73387) este un copil născut în stațiunea Imperial într-o sarcină de 34 de săptămâni, în familia unui frate pakistanez britanic al vărului primar. Examinările prenatale au arătat că este mică în gestație, cântărind 1, 19 kg la naștere, cu o circumferință a capului de 26, 7 cm, mult sub 0,4 centil. A apărut inducerea travaliului datorită întârzierii creșterii, dar a eșuat, ducând la o operație cezariană de urgență. Scorul Apgar a fost de 4 în 1 min, 7 în 5 min și 9 în 10 min. A fost internată în secția de terapie intensivă neonatală pentru ventilație continuă cu presiune pozitivă a căilor respiratorii.
Genetica moleculară
ADN-ul genomic total a fost obținut utilizând metode standard și regiunea de codificare plus limitele intronului și exonului mai multor ansambluri COX (SURF1, SCO1, SCO2, COX10, COX14, COX15, COA5, LRPPRC, TACO1, FAM37A) și genele structurale (NDUFA4) au fost amplificate cu utilizarea primerilor specifici locusului (secvențe disponibile la cerere), secvențiat folosind kitul BigDye v3.1 și electroforeză capilară pe platforma de secvențiere fluorescentă ABI3130xl (Life Technologies, Warrington, Marea Britanie).
Secvențierea întregului exom a fost efectuată pentru a determina baza genetică pentru prezentarea bolii mitocondriale a copilului, așa cum a fost descris mai sus. SureSelect Human All Exon 50 Mb V5 Kit (Agilent, Santa Clara, CA, SUA) a fost folosit pentru a îmbogăți fragmentele de ADN de codificare și secvențierea a fost efectuată pe un sistem HiSeq2000 (Illumina, San Diego, CA, SUA). BWA (versiunea 0.5.8) a fost utilizat pentru a alinia citirea cu kitul de referință uman (hg19) și variantele cu nucleotide unice (SNV), iar inserțiile mici și ștergerile au fost detectate folosind SAMtools (versiunea 0.1.7). Acoperirea medie a fost de 128 de ori și> 97% din aria țintă a fost acoperită de cel puțin 20 de ori, permițând apeluri de înaltă fiabilitate. Statisticile detaliate de secvențiere sunt prezentate în Tabelul 1.
Tabel în dimensiune completă
Liza celulară și Western blot
Fibroblastele cultivate au fost recoltate și lizate în 50 mM Tris-HCI pH 7,5, 130 mM NaCI, 2 mM MgCl 2, 1 mM fluorură de fenilmetansulfonil (PMSF), 1% Nonidet P-40 (v/v) și 1x inhibitor fără inhibitori EDTA. proteaze (Pierce, Rockford, IL, SUA). Lizatele proteice (40 μg) au fost separate prin mărime pe geluri de 12% folosind electroforeză pe gel de dodecil sulfat de sodiu - poliacrilamidă (SDS-PAGE) și transferate electroforetic la o membrană PVDF (Immobilon-P, Millipore Corporation, Darmstadt, Germania). Imunoblotarea a fost efectuată folosind anticorpi secundari primari și HRP conjugați.
Pregătirea mitocondrială și electroforeza nativă albastră
Fibroblastele cultivate au fost recoltate, resuspendate în tampon de omogenizare (HB) (0,6 M manitol, 1 mM acid etilen glicol tetraacetic, 10 mM Tris-HCl pH 7, 4,1 mM PMSF și 0,1% (v/v). Albumină serică bovină (BSA) )) și supus unei tranziții de omogenizare de 3 x 15 folosind un omogenizator de sticlă de teflon la 4 ° C. Centrifugarea diferențială standard (400 g timp de 10 minute) a fost utilizată pentru îndepărtarea nucleilor și resturile celulare și mitocondriile au fost în cele din urmă granulate la 11 ° C. 000 g timp de 10 minute la 4 ° C. Mitocondriile au fost spălate în HB fără BSA și peleta finală a fost dizolvată în n-dodecil-β-D-maltozidă (DDM) (Sigma) la 2 mg/mg proteină pe gheață timp de 20 minute. După centrifugare (100.000 g timp de 15 minute la 4 ° C), supernatantul a fost colectat și Coomassie Blue G-250 (AMS Biotechnology (Europe) Ltd, Abingdon, Marea Britanie). Proteinele membranei mitocondriale (50 μg) au fost încărcate pe un gel NativePAGE 4-16% BisTris (Life Technologies), separate electroforetic și transferate într-o membrană PVDF. Membrana a fost apoi imunoblotată cu anticorpi împotriva complexelor OXPHOS.
imunoblotare
Următorii anticorpi primari au fost utilizați pentru imunoblotare: NDUFA9 (Molecular Probes, Eugene, OR, SUA, A21344), NDUFB8 (Abcam, Cambridge, Marea Britanie, ab110242), SDHA (MitoSciences, Eugene, OR, SUA, MS204), UQCRC2 (Abcam, ab14745), COX1 (Abcam, ab14705) și COX2 (Molecular Probes, A6404), ATP5A (Abcam, ab14748), ATPB (Abcam, ab14730) și TOM20 (Santa Cruz, Heidelberg, Germania, sc11415). Au fost utilizați anticorpi anti-șoareci sau anti-iepure conjugați cu HRP (P0260 și P0399; Dako, Glostrup, Danemarca). Kitul de chimiluminiscență ECL Prime Kit (Amersham, Little Chalfont, Marea Britanie) și sistemul de imagistică ChemiDocMP (Bio-Rad, Hemel Hempstead, Marea Britanie) au fost utilizate pentru detectarea semnalului și software-ul Image lab 4.0.1 (Bio-Rad) pentru analiză.
Rezultatul
Histochimia musculară și analiza lanțului respirator
Analiza biopsiei musculare a pacientului a arătat o pierdere severă și globală a activității histochimice COX pe tot parcursul (neprezentată), confirmată de un test spectrofotometric al activităților lanțului respirator, care a demonstrat deficiență severă și izolată a complexului IV în omogenatul muscular (Figura 1a). ). Această observație a fost confirmată la pacienții cu fibroblaste la care activitatea complexului IV a fost semnificativ redusă (Figura 1b).
Identificarea deficitului lanțului respirator mitocondrial izolat al complexului IV la mușchi și fibroblaste și analiza variantei PET100. Evaluarea activității enzimelor lanțului respirator individual în mușchi ( A ) și fibroblaste ( b ) a identificat un complex OXPHOS sever care afectează complexul IV în izolarea pacientului (bare albastre) comparativ cu martorii (bare roșii); activitățile enzimatice medii prezentate pentru controlul muscular (n = 25) și controlul fibroblastelor (n = 10) sunt determinate a fi 100%. ( c ) Pedigree familial, care confirmă starea transportatorului p. (Gln48 *) la părinți neafectați clinic, în timp ce probandul este homozigot pentru varianta de trunchiere.
Imagine la dimensiune completă
Studiile genetice moleculare identifică o nouă variantă trunchiată a PET100
Mutația PET100 duce la deteriorarea complexului IV
O caracterizare suplimentară a naturii defectului biochimic asociat cu varianta PET100 a fost efectuată la fibroblastele pacienților. Nivelurile de echilibru ale subunităților individuale ale complexului OXPHOS și asamblarea ulterioară în complexe ale lanțului respirator mitocondrial au fost analizate prin PAGE nativ albastru (BN-PAGE) și SDS-PAGE.
Analiza nivelurilor stării de echilibru ale componentelor complexului OXPHOS a confirmat o scădere semnificativă a COXI și COXII la pacienți, comparativ cu fibroblastele martor (Figura 2a). Nu s-au găsit modificări semnificative în niciunul dintre nivelurile stării de echilibru ale tuturor celorlalte complexe analizate (I, II, III și V), deși nivelurile complexului III au crescut în conformitate cu enzima lanțului respirator.
De 1,6 ori pe baza analizei densitometrice (Figura 2a). O observație similară a fost făcută anterior la pacienții cu variante patogene în altă genă a kitului COX, SURF1. 28 TOM20 a fost utilizat ca marker introductiv mitocondrial și a confirmat aceeași încărcare a proteinelor de control și a pacientului mitocondriale.
Niveluri de echilibru ale componentelor și complexelor OXPHOS. ( A ) Lizat celular de la control (C1 și C2) și pacient (P) fibroblaste (40 μg) a fost analizat prin SDS-PAGE (12%) și imunoblotare. Anticorpii specifici subunității au fost folosiți împotriva CI (NDUFA9, NDUFB8), CII (SDHA), CIII (UQCRC2), CIV (COX1, COX2) și CV (ATPB). Markerul de membrană mitocondrială externă, TOM20, a fost utilizat ca control al încărcării. ( b ) Proteinele mitocondriale (50 μg) izolate de la pacienți (P) și fibroblastele de control (C1) au fost analizate prin BN-PAGE unidimensional (gradient de 4 până la 16%) folosind anticorpi specifici subunității, așa cum s-a indicat (CI (NDUFA9)). CII (SDHA), CIII (UQCRC2), CIV (COX1) și CV (ATP5A)) pentru a evalua ansamblul complexelor OXPHOS individuale. Complexul II (SDHA) a fost utilizat ca control al încărcării.
Imagine la dimensiune completă
În concordanță cu această reducere a nivelurilor de proteine CIV la starea de echilibru și măsurători biochimice ale activității complexului lanțului respirator (Figura 1b), analiza BN-PAGE a relevat cantități semnificativ reduse de complex IV complex în celulele pacienților, comparativ cu controalele adaptate la vârstă (Figura 2b). Această pierdere a complexului OXPHOS a fost specifică deoarece profilul de asamblare al complexelor I, II, III și V a fost normal.
Aceste date indică faptul că varianta homozigotă p100 (Gln48 *) PET100 are ca rezultat o pierdere specifică și severă a subunităților COX și un complex IV complet asamblat.
discuţie
Deși deficiența de COX izolată a fost considerată una dintre cele mai frecvente tulburări ale metabolismului energetic, are o etiologie genetică diversă care reflectă natura complexă a biogenezei și asamblării componentelor mtDNA și a componentelor codificate nucleare într-o holoenzimă matură; un proces facilitat de multe proteine chaperone. Variantele patogene au fost descrise într-o serie de factori de asamblare necesari pentru formarea unei enzime COX funcționale. 9, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 S-a identificat recent o mutație fondatoare în factorul de asamblare COX extrem de conservat PET100 la 10 indivizi libanezi cu deficit de COX izolat care au sindrom Leigh și convulsii. 24
Aici, raportăm că o nouă variantă a PET100 trunchiată provoacă acidoză lactică infantilă fatală și deficit de COX izolat la un copil născut de un părinte britanic pakistanez nativ. Varianta de prostie patogenă (c.142C> T, p. (Gln48 *)) din gena PET100 a fost identificată prin secvențierea întregului exom, ducând la afectarea activității enzimei complexe IV și asamblarea COX anormală. Rezultatele noastre sunt în concordanță cu datele publicate anterior care sugerează că PET100 este un factor de biogeneză conservat implicat în maturarea complexului IV la omul 24 și drojdie. 21, 22, 23 Omologul de drojdie PET100 nu este esențial pentru localizarea polipeptidelor COX la membrana mitocondrială internă 21, dar joacă un rol major în procesele de asamblare ulterioare, unde facilitează asamblarea intermediarilor COX. În schimb, PET100 uman pare a fi necesar mai devreme în procesul de asamblare a subunităților COX codificate mitocondrial. Rezultatele noastre demonstrează importanța PET100 în funcția de OXPHOS și susțin studiile anterioare; 21, 22, 23, 24, însă, necesită investigații suplimentare pentru a înțelege pe deplin rolul exact al acestei enzime în maturarea holoenzimei COX.
Secvențierea întregului exoma este o abordare rapidă și eficientă pentru a elucida bazele moleculare ale tulburărilor lanțului respirator mitocondrial, inclusiv deficitul de COX izolat. Rezultatele noastre confirmă PET100 ca o genă importantă a bolii candidate la pacienții cu deficit de COX izolat. Progresele recente în secvențierea generației următoare au permis diagnosticarea rapidă și precisă a pacienților cu boală mitocondrială simplă în familiile mici, facilitând consilierea adecvată și furnizarea de strategii preventive, cum ar fi diagnosticul prenatal și profilarea genetică preimplantare.