abstract
Gena receptorului activinei de tip II (ACTRII) este mutată în 58,1% din carcinoamele colorectale instabile cu microsateliți (MSI-H) și este o rudă apropiată a receptorului TGFβ-1 de tip II, despre care se știe că este implicat în MSI-H și - Carcinogeneza colorectală MSI-H. Prin urmare, am căutat să determinăm dacă ACTRII a fost implicat în cancerele colorectale non-MSI-H. Am evaluat inactivarea ACTRII prin deleție alelică, pierderea expresiei ARNm sau mutație somatică în 51 de carcinoame de colon non-MSI-H. Pierderea heterozigozității (LOH) la locusul ACTRII (2q23.1) a fost constatată în 9 (17,6%) 51 de tumori primare. Pierderea expresiei mRNA ACTRII a fost observată la una (14,3%) din șapte tumori primare LOH-pozitive din care ARN total era disponibil. De asemenea, am efectuat analiza secvenței ADN a tumorilor care prezintă LOH. O tumoare primară LOH-pozitivă a prezentat o modificare a secvenței liniei germinale (substituție de aminoacizi, 117 Ile la Phe) care nu a fost detectată la alți 23 de indivizi normali, indicând faptul că această modificare nu este un polimorfism comun. Concluzionăm că ACTRII este probabil implicat în carcinogeneza colorectală a non-MSI-H și MSI-H, dar mai des în al doilea subgrup.
Principalul
Cancerul colorectal este a doua cauză principală de decese cauzate de cancer în Statele Unite și a treia cea mai frecventă cancer la ambele sexe, cu 135.400 de cazuri noi și 56.700 de decese în 2001 (American Cancer Society, 2001). Prin urmare, este esențial să descoperiți și să înțelegeți mai bine căile moleculare care stau la baza acestui tip de cancer, inclusiv identificarea noilor gene supresoare tumorale, precum și mecanismele implicate în inactivarea lor.
Gena receptorului activinei de tip II (ACTRII) a fost identificată prin screeningul mutațional al mutațiilor la nivelul genomului ca o nouă genă supresoare tumorală candidată mutată foarte frecvent (în 58,1% carcinoame colorectale MSI-H, adică tumori cu instabilitate ridicată a microsateliților) la (A ) 8 mononucleotide se repetă în regiunea sa de codificare (Mori și colab., 2001). ACTRII este un membru al familiei de receptori β (TGF-β) a factorului de creștere transformator și este asociat cu calea de semnalizare activină-SMAD, care la rândul său este implicată în inducerea diferențierii, suprimării creșterii și apoptozei în diferite tipuri de celule, inclusiv cele derivate din epiteliul intestinal (Attisano și colab., 1996; Sonoyama și colab., 2000). Interferența cu calea de semnalizare ACTRII inhibă diferențierea celulară in vitro (Li și colab., 1998; Liu și colab., 2000) și apoptoza (Chen și colab., 2000; Choi și colab., 2001). Calea de semnalizare TGF-β-SMAD, care împarte efectorii în aval SMAD2 și SMAD4 cu calea activin-SMAD, este responsabilă pentru suprimarea tumorii umane (Attisano și colab., 1996; Liu și colab., 2000; Sonoyama și colab., 2000; Su și colab., 2001). ACTRII formează un complex activ de receptori heterodimerici cu ACTRI (Attisano și colab., 1993). Interesant este că mutația somatică ACTRI a fost recent descrisă în cancerul pancreatic (Su și colab., 2001).
Pentru a determina dacă ACTRII a fost implicat în toate tumorile colorectale și nu în cele care au avut instabilitate frecventă a microsateliților, am studiat inactivarea ACTRII în tumorile non-MSI-H. Am efectuat o pierdere detaliată a studiilor de heterozigoză (LOH) 2q22.1-q23.3, regiunea care conține gena ACTRII, în 51 de tumori colorectale non-MSI-H. Tumorile LOH-pozitive au fost testate în continuare pentru mutații punct somatice în ACTRII .
Rezultatul
Alelotiparea a arătat că 17 (33%) 51 de tumori colorectale au prezentat LOH la unul sau mai mulți din patru loci de pe cromozomul 2q23.1. Aceste rezultate sunt rezumate în Tabelul 1. Locus D2S141 a arătat cea mai mare rată LOH (12 din 27 de cazuri informative sau 44,4%). Nouă (17,6%) din cele 51 de tumori aveau LOH flancând locusul ACTRII: acestea includeau 7 adenocarcinoame și 2 adenoame, dintre care unul conținea displazie focală de grad înalt.
Tabel în dimensiune completă
RT-PCR cantitativ a arătat că unei tumori îi lipsea complet expresia ACTRII mARN (Fig. 1). Această constatare a fost confirmată de mai multe teste repetate. Secvențierea ADN a celor șase tumori rămase din care ARN era disponibil a arătat că conținea o singură schimbare de nucleotide (TTT în ATT, substituție de aminoacizi Ile în Phe) la codonul 117 din domeniul extracelular al ACTRII. Această modificare a secvenței a apărut și în eșantionul normal corespunzător (Fig. 2). În plus, polimorfismul silențios la codonul 118 (CCG la CCA) a fost detectat la 3 (50%) din 6 probe tumorale primare; S-a constatat că acest polimorfism a fost descris anterior (D'Abronzo și colab., 1999). Acest polimorfism a fost observat și în cinci (62,5%) din cele opt linii celulare de cancer colorectal pe care le-am studiat (D'Abronzo și colab., 1999). În cele din urmă, printre aceste opt linii celulare, am detectat o ștergere a unei baze în repetarea (A) 8 la codonul 437 din celulele SW48, despre care se știe că sunt MSI-H (Branch et al, 1995).
Expresia genei ACTRII în tumorile LOH. Analiza RT-PCR a probelor de pierdere de heterozigoză (LOH) +. Această imagine prezintă o imagine în gel a produsului RT-PCR pentru șapte tumori LOH-pozitive. Rezultatele pentru β-actină RT-PCR sunt prezentate ca un control intern. RT-PCR a fost efectuat conform protocolului Invitrogen/Life Technologies. Condițiile PCR au fost descrise anterior (Mori și colab., 2001). Fragment de sus, 1100-bp al genei ACTRII; ADN, 436-bp RT-PCR produs al genei β-actinei. Banda 6 reprezintă o lipsă completă a expresiei mARN a genei ACTRII .
Imagine la dimensiune completă
Schimbarea secvenței liniei germinale în ACTRII. Schimbarea nucleotidelor la codonul 117. O nucleotidă se schimbă de la T normal (stânga) la A (dreapta) la codonul 117, rezultând o schimbare a aminoacizilor de la Ile la Phe în domeniul extracelular al receptorului. Figurile arată secvența de sens și codonul 117 este indicat în ambele panouri. Săgeata indică nucleotida mutantă.
Imagine la dimensiune completă
discuţie
ACTRII este adesea mutat în cancerele colorectale MSI-H (Mori și colab., 2001). În plus, se știe că activina joacă un rol în creșterea și diferențierea celulelor intestinale (Attisano și colab., 1996; Sonoyama și colab., 2000). În cele din urmă, există asemănări structurale și funcționale puternice între receptorii activinei și TGF-β (Attisano și colab., 1993), din care se știe că acesta este implicat atât în tumorigeneză colorectală MSI-H, cât și non-MSI-H (Calin et al. al., 2000; Grady și colab., 1998, 1999; Orimo și colab., 1998). Din aceste motive, am studiat modificările somatice ale genei ACTRII în cancerele colorectale fără MSI-H. Apariția unei deleții alelice la 2q23,1 în două adenoame (unul cu displazie focală), precum și în șapte adenocarcinoame sugerează că LOH la acest locus poate apărea la debutul neoplaziei colorectale.
Pentru a evalua dacă ștergerea unei alele ACTRII a fost asociată cu inactivarea alelei rămase, am efectuat secvențierea ADN a întregii regiuni de codificare ACTRII în șapte tumori primare LOH-pozitive din care ARN era disponibil, precum și în opt celule canceroase colorectale. linii. Această analiză mutațională a relevat, pe lângă polimorfismul silențios la codonul 118 din cinci dintre cele opt linii celulare și trei din cele șase tumori care exprimă ACTRII, singurul pacient cu o nouă modificare la codonul 117 din tumoră și în probele normale corespunzătoare.
În special, modificarea codonului 117 (I117F) găsită într-o tumoare primară nu a fost descrisă anterior. Pentru a determina dacă I117F reprezintă o mutație a liniei germinale sau polimorfism, am secvențiat ADN genomic normal de la alți 23 de indivizi, concentrându-ne pe al doilea exon al genei ACTRII (care conține codonul 117). Niciunul dintre acești indivizi nu a avut această modificare, sugerând că I117F nu este un polimorfism comun în populația generală.
Pentru a investiga implicarea codonului 117 ACTRII în tumorigeneză umană în general, am efectuat o căutare în literatură. Trei aminoacizi din domeniul extracelular al ACTRII, 42F, 60W și 83F, sunt cunoscuți a fi implicați în legarea activinei și inhibinei la ACTRII: mutațiile acestor reziduuri în receptorul de lungime completă provoacă perturbarea legării activinei și inhibinei (Gray și colab., 2000).
O lipsă completă a expresiei mARN-ului ACTRII a fost găsită într-una din cele șapte tumori primare non-MSI-H pozitive LOH, dar în niciuna dintre cele opt linii celulare de cancer colorectal. Este posibil ca hipermetilarea promotorului să fi cauzat această lipsă de expresie; cu toate acestea, regiunea promotor pentru ACTRII nu a putut fi identificată în bazele de date publice de secvențe de ADN și nici insulele CpG din amonte nu au fost găsite la locusul genomic ACTRII. În cele din urmă, a fost observată o mutație la codonul 437, care a dus la proteina trunchiată prezisă, în SW48, singura linie celulară de carcinom colorectal studiată, MSI-H.
Aceste date sugerează că modificările genetice ale genei ACTRII (adică, mutația missense, pierderea completă a expresiei ARNm și LOH) apar în cazurile de cancer colorectal non-MSI-H, dar la o frecvență mai mică decât în cazurile de cancer MSI-H. Astfel, evenimentele despre care se crede că duc la inactivarea ACTRII apar atât în tumorile colorectale MSI-H, cât și în cele non-MSI-H, susținând în continuare candidatura ACTRII ca genă supresoare tumorale colorectale.
Materiale și metode
Pregătirea țesuturilor, extracția ADN și ARN
Cincizeci și unu de carcinoame colorectale non-MSI-H care prezintă MSI în cel mult unul dintre cele cinci situri de consens (BAT 25, BAT 26, D2S123, D5S346 și D17S250) au fost obținute cu țesuturi de control normale corespunzătoare. Toate probele au fost prelevate în momentul operației sau endoscopiei și congelate imediat în azot lichid. ADN-ul și ARN-ul au fost extrase din probe de țesut înghețat folosind kitul DNeasy Tissue și kitul RNeasy Mini de la Qiagen (Valencia, California) conform protocolului producătorului.
Analiza distribuției
Patru markeri microsateliți localizați în regiunea de 17 Mb pe 2q22.1-q23.3, inclusiv gena ACTRII (2q23.1) au fost utilizați pentru studiul LOH: D2S127, D2S151, D2S2299 și D2S141 (Tabelul 2). Gena ACTRII este localizată între D2S151 și D2S2299. Reacțiile PCR au fost efectuate într-un volum total de 10 μl conținând 20 ng de ADN genomic, 0,5 μm din fiecare primer, 1 x tampon Taq polimerază (Life Technologies, Gaithersburg, Maryland), câte 0,1 mm fiecare din dNTP, 1,5 mm MgCl și 0, 1 UI Taq ADN polimerază (Life Technologies). Condițiile PCR au fost descrise anterior (Mori și colab., 2001). Zece microlitri din fiecare produs PCR au fost analizați pe un secvențiator automat de ADN (MegaBace 1000; Amersham LifeSciences/Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) utilizând software-ul Genetic Profiler, versiunea 1.0 (Amersham Life Sciences/Molecular Dynamics). Am clasificat modificarea specifică tumorii ca LOH atunci când a avut ca rezultat o schimbare de peste 50% din înălțimea maximă a alelei tumorale în comparație cu valoarea normală corespunzătoare.
Tabel în dimensiune completă
Analize mutaționale
RT-PCR pentru nivelurile de expresie și secvențierea ADNc.
ARN a fost disponibil din șapte tumori LOH-pozitive, precum și din opt linii celulare de cancer colorectal (SW480, SW48, Colo320HSR, WiDr, SW620, SW948, Colo201 și Colo32DM). Transcrierea inversă a folosit 10 μg de ARNm total într-un volum total de reacție de 20 μl, conținând 0,5 μg Oligo dT (Invitrogen, Carlsbad, CA), amestec dNTP de 0,1 mm (Invitrogen), 4 μl 5x First-Strand Buffer (ibid), 2 μl de 0,1 m ditiotreitol (Invitrogen) și 1 μl de RNază OUT 40 U/μl ribonuclează inhibitor (Invitrogen). Protocolul PCR a fost realizat într-un volum total de 20 μl, conținând 1,75 μl primer (Invitrogen), 0,1 mm dA/T/C/GTP, 0,1 μl ADN polimerază Taq (Qiagen) și 10x tampon Taq polimerază (Qiagen). în aceleași condiții descrise în analiza alelotipului. Controlul RT-PCR intern pentru gena β-actină a constat din același protocol, cu primeri 5 Index-IndexTerm IndexTerm CCA GAG CAA GAG AGG TAT CC-3 ′ și 5′-IndexTerm IndexTerm CTG TGG TGG TGA AGC TGT AG-3 '. Electroforeza produsului PCR a fost efectuată pe un gel de agaroză 1,5%. Analiza secvenței a fost efectuată atât pe firele sensibile, cât și pe cele antisens ale ADNc obținute prin RT-PCR.
Analiza secvenței CDNA.
Reacțiile secvențiale au fost efectuate folosind un kit de terminare DYEnamic ET (Amersham Pharmacia Biotech) conform protocolului producătorului. Electroforeza a fost efectuată pe un instrument MegaBace 1000 (Molecular Dynamics) și analizată folosind software-ul Sequence Analyzer, versiunea 2.0 (Amersham Pharmacia Biotech). Secvențele ADN din tumori sau linii celulare au fost comparate cu secvența ACTRII de tip sălbatic obținută din baza de date a Centrului Național pentru Informații despre Biotehnologie (NCBI) (www.ncbi.nlm.nih.gov). ADN-ul genomic din 24 de cancere colorectale a fost secvențiat pe cel de-al doilea exon al genei ACTRII conform protocolului descris mai sus, folosind primerii 5'-IndexTerm IndexTerm TTC TCT GCT TAT TTA TAG GAC TG-3 ′ și 5′-IndexTermTTTTTTTTTTT TCC AAT CTA CAG TTG AGC -3 ′.
Mulțumiri
Această lucrare a fost parțial susținută de subvențiile DK47717, CA95323, CA85069 și CA63670 și CA77057.