obiecte

abstract

Principalul

În ultimii ani, s-a demonstrat că receptorul farnesoid X (FXR, cunoscut și sub numele de NR1H4), un receptor de detectare a acidului biliar nuclear, joacă un rol cheie în menținerea homeostaziei acidului biliar. 2, 3, 4 FXR este implicat în controlul sintezei acidului biliar în ficat și a transportului acidului biliar prin circulație enterohepatică. Acest receptor nuclear este exprimat în ficat și intestine, precum și în alte organe și țesuturi, cum ar fi glandele suprarenale și țesutul adipos. 5, 6 La activare, FXR hepatic suprimă sinteza acidului biliar prin reglarea transcripțională a enzimei Cyp7A1, 7, 8, care catalizează primele etape de control al ratei în cascada primară de sinteză a acidului biliar. Un studiu anterior din laboratorul nostru a arătat că șoarecii FXR-nuli au prezentat, așa cum era de așteptat, niveluri crescute de expresie a genei cyp7A1 în ficat. Mai mult, s-a dovedit că acești șoareci au o rată crescută de sinteză a acidului colic și o dimensiune crescută a rezervei de acid colic. 3

Cu toate acestea, pe lângă efectele inhibitoare ale ficatului FXR activat, Cyp7A1 este reglementat de câteva alte mecanisme independente și dependente de FXR. Mai mulți factori de transcripție dependenți de Ceas sunt implicați în menținerea expresiei circadiene a Cyp7A1, adică Dbp, Rev-erb și E4BP4. 9, 10, 11 În plus, este de interes o metodă mediată de FXR de control al expresiei hepatice Cyp7A1 mediată de semnalizarea indirectă a intestinului subțire. Activarea indusă de acidul biliar al FXR intestinal induce expresia factorului de creștere a fibroblastelor de șoarece 15 (Fgf15) 12 și a ortologului său uman FGF19. Spre deosebire de majoritatea celorlalte proteine ​​Fgf, Fgf15/19 are o afinitate slabă de legare pentru heparină, permițându-i să scape de pre-captare în matricele extracelulare. Ca rezultat, Fgf15 obținut din intestin este capabil să ajungă la ficat și să acționeze ca un factor endocrin. La activarea receptorului său hepatic, izotipul 4 al receptorului Fgf (FGFR4), care necesită p-Klotho ca co-receptor pentru funcționalitate optimă, este suprimat prin expresia Cyp7A1. 14, 15

Kim și colab. 16 au comparat recent metabolismul acidului biliar la șoareci knockout FXR specifici ficatului și intestinului pentru a examina contribuțiile relative ale FXR hepatice și intestinale în controlul sintezei acidului biliar. Cu toate acestea, concluziile lui Kim și colab. 16 se bazează doar pe diferențe relativ mici în nivelul expresiei genelor. În acest studiu, abordăm contribuția relativă a căii FXR-Fgf15 la sinteza hepatică a acidului biliar nu numai prin examinarea modificărilor nivelurilor de expresie a genei, ci mai important, prin determinarea efectului ștergerii selective FXR intestinale asupra parametrilor fiziologici. precum formarea bilei și cinetica circulației enterohepatice a acidului biliar. În plus, contribuția relativă a căii de semnalizare intestinală FXR-Fgf15 este determinată în timpul modulației alimentării cu acid biliar prin alimentarea cu acid biliar și sechestrarea acidului biliar. Fgf15 contribuie la reglarea sintezei acidului biliar la șoareci în principal în faza întunecată. Extinderea depozitelor circulante de acid biliar și sechestrarea acidului biliar reduc rolul semnalizării intestinale FXR-Fgf15 în controlul sintezei acidului biliar și a producției de acid biliar.

REZULTATELE

Caracteristicile șoarecelui selectiv intestinal selectiv intestinal Fxr knockout

Profilurile de expresie ale ARNm ale Fxr și Fgf15 de-a lungul intestinului subțire au fost analizate prin RT-PCR. Așa cum se arată în Figura 1, expresia ARNm Fxr era de așteptat să fie cea mai mare în intestinul subțire distal al șoarecilor WT. Fgf15 a fost exprimat în principal în ileonul distal al șoarecilor WT, dar modelul său de expresie nu se potrivea complet cu expresia Fxr. Șoarecii IFXR-KO au prezentat absența practic completă în Fxr și o reducere puternică (reducere medie: 82%) a expresiei Fgf15 de-a lungul intestinului. Țintele FXR au fost analizate în trei segmente instestinale (proximal, mediu și distal) și s-au constatat că sunt exprimate la niveluri inferioare în intestinul subțire al șoarecilor iFXR-KO, adică expresia Ibabp și Ost-α a crescut spre direcția distală și terminal ileonul a fost redus cu 87 și 49% la șoarecii iFXR-KO (datele nu sunt prezentate). Expresia ileală a Asbt, despre care se știe că nu este reglată de FXR la șoareci, 4 crește în direcția distală fără a arăta diferențe între cele două grupuri. Shp, o importantă genă țintă FXR în ficat, s-a dovedit a fi exprimată predominant în partea proximală a intestinului subțire în ambele grupuri și nu s-a putut detecta nicio diferență între iFXR-KO și șoarecii martor.

mediată

Model relativ al expresiei genice de-a lungul intestinului subțire. Intestinul subțire al șoarecilor masculi de tip sălbatic (WT) (cercuri deschise, n = 3) și șoarecilor knock-out selectivi FXR intestinali masculi (cercuri solide, n = 3) au fost spălați cu PBS și șase segmente au fost excizate; 0, 33, 66, 83, 90 și 100% (distanța relativă de la stomac la ileonul distal). Nivelurile relative de expresie ale genelor Fxr și Fgf15 comparativ cu 18S au fost analizate prin RT-PCR. Valorile sunt exprimate ca medie ± sd

Imagine la dimensiune completă

La vârsta de 3 luni, greutatea corporală și hepatică a șoarecilor iFXR-KO au fost semnificativ mai mici decât cele ale coechipierilor WT (Tabelul 1), dar raporturile dintre ficat și greutatea corporală nu au diferit între grupuri. Diferențele observate în ceea ce privește greutatea corporală și greutatea ficatului au fost consistente, adică au fost observate la toate categoriile de vârstă de la 4 la 28 de săptămâni și au rămas după alimentarea unor diete specifice (datele nu sunt prezentate și tabelul S2 suplimentar). În afară de creșterea relativ ușoară a indusilor TCA, nu s-au observat diferențe în activitățile plasmatice AST și ALT între iFXR-KO și șoarecii martor (Tabelul 1 și Tabelul suplimentar S2). În plus, nu s-au observat diferențe în morfologia ficatului între grupuri (Figura 2). Tabelul 1 arată în plus că greutatea corporală scăzută la șoarecii iFXR-KO nu s-a datorat consumului redus de alimente. Șoarecii cu deficit de FXR din corpul întreg prezintă niveluri crescute de lipide plasmatice, 3, 4 cu niveluri ridicate de colesterol plasmatic și trigliceride. În schimb, nu am găsit diferențe semnificative în conținutul de lipide din plasmă sau ficat între șoarecii WT și iFXR-KO hrăniți cu o dietă (Tabelul 1).

Tabel în dimensiune completă

Morfologie hepatică pe hrană, 0,5% TCA sau 2% Colesevelam HCl alimentat cu diete hrănite cu WT și șoareci knock-out FXR selectivi intestinali. Examenul histologic al morfologiei ficatului a fost evaluat prin colorarea hematoxilinei/eozinei (vezi „Materiale și metode”). Morfologia hepatică a șoarecilor knock-out WT și FXR selectați în intestin, 0,5% TCA sau 2% dietă îmbogățită cu Colesevelam HCl este reprezentată la o mărire de 20x. '*' Reprezintă hepatocite periportale; # reprezintă hepatocite pericentrale.

Imagine la dimensiune completă

Efectele dependente de timp ale deficitului de Fxr selectiv intestinal asupra cp7A1 hepatică și expresia intestinală a Fgf15 \ t

Datorită ritmului zilnic binecunoscut al expresiei hepatice Cyp7A1, 3, 13, 23, am examinat efectele deficitului de FXR intestinal asupra expresiei zilnice a Cyp7A1 hepatic în patru momente de timp diferite, adică la 0100, 0700, 1300 și 1900 ore . Nu s-au observat diferențe între sexe (datele masculine nu sunt prezentate).

La începutul perioadei întunecate (1900 ore), expresia ficatului Cyp7A1 a fost cea mai mare în ambele grupuri, așa cum era de așteptat (Figura 3). Expresia Cyp7A1 a fost semnificativ mai mare doar noaptea (1900 - 0700 ore) la șoarecii iFXR-KO comparativ cu controalele WT. Expresia Cyp8B1, necesară pentru producerea de acid colic, nu a prezentat o variație clară peste noapte și nu a fost afectată semnificativ la șoarecii iFXR-KO. În plus, nu s-au observat diferențe în expresia hepatică Fxr și Shp între cele două grupuri. Observând acest efect dependent de timp al deficienței IFXR asupra expresiei Cyp7A1, am întrebat dacă absența semnalizărilor intestinale FXR și Fgf15 acționează prin factori de transcripție (Dbp, Rev-erbα și/sau E4bp4) implicați în reglarea ritmicității circadiene Cyp7A1. expresie. Figura 3 arată că acești factori de transcripție au prezentat un profil circadian distinct în profilul lor de expresie, dar modelele de expresie au fost foarte asemănătoare la ambele tulpini. Doar Dbp și Rev-erbα au prezentat o expresie crescută la șoareci WT la un moment dat (1900 ore), ceea ce în mod clar nu explică diferențele în expresia Cyp7A1 .

Profilul expresiei circadiene a genelor implicate în reglarea sintezei acidului biliar. Nivelurile de expresie genică (comparativ cu expresia 18S) au fost măsurate în patru momente de timp (0700, 1300, 1900 și 0100 ore) la 6-7 martori de tip sălbatic feminin (cercuri deschise) sau la șoareci femele selectivi intestinali FXR (cercuri închise). Datele sunt prezentate deoarece media ± sd a Cyp7A1 și Cyp8B1 sunt enzime cheie în sinteza acidului biliar, Shp este al doilea mesager al FXR și Dbp, Rev-erbα și E4bp4 sunt implicate în menținerea ritmului circadian al expresiei Cyp7A1. '#' Reprezintă o diferență semnificativă cu P

Profil circadian al expresiei genelor intestinale. Nivelurile de expresie genică (în raport cu 18S) au fost măsurate în patru puncte de timp (0700, 1300, 1900 și 0100 ore) în ileonul terminal de cm 4 cm proximal sfincterului ileocecal fie la femelele de control sălbatic (cercuri deschise), fie la intestinul feminin - șoareci selectivi FXR knockout (cercuri închise); N = 4. Datele sunt exprimate ca medie ± sd Fgf15 este un factor de creștere a cărui expresie este indusă de FXR intestinal activ; Ibabp, o proteină de legare a acidului biliar ileal, este o genă țintă FXR intestinală. '#' Reprezintă o diferență semnificativă cu P

Debitul biliar ( A ) și producția de biliard ( b - d ) la șoareci de tip sălbatic (WT) și șoareci knock-out selectivi intestinali FXR hrăniți fie cu alimente îmbogățite, 0,5% TCA, fie cu 2% Colesevelam HCl. După o dietă de 0,5% îmbogățită în TCA sau o dietă de 2% îmbogățită în 2% Colesevelam HCI timp de trei și respectiv 7 zile, șoarecii (N = 5) au fost supuși canulației biliare. Ca rezultat, s-au atins performanța fluxului biliar și a căilor biliare. Coloane deschise: colegi de gunoi WT, coloane închise: șoareci knockout selectivi FXR intestinali. Valorile sunt exprimate ca medie ± sd '*' Reprezintă semnificația statistică P # este semnificația statistică (P

Efectele deficitului selectiv de FXR intestinal asupra degradării [2H4] -colatului ( A ), dimensiunea containerului b ), rata de rulaj fracționată c ) și rata de sinteză ( d ). Șoarecii au fost supuși canulării biliare așa cum este descris în secțiunea Proceduri experimentale. ( A - d ) sunt derivate din măsurători ale îmbogățirii izotopului [2H4] -colat în plasmă de tip sălbatic (WT) și șoareci knock-out FXR selectivi intestinali. N = 6 pe tulpină: șoareci WT (bare deschise) și șoareci knock-out FXR selectivi intestinali (bare închise). Datele sunt exprimate ca medie ± diferență semnificativă SD # (de 30 de ori) și expresia Fgf15 (> 30 de ori) în ileonul terminal al controlului. mouse. A existat o creștere relativ mică a expresiei Shp în ficat, exclusiv la șoareci iFXR-KO. Cu toate acestea, Figura 7 arată o reglare descendentă clară a expresiei Cyp7A1 și Cyp8B1 atât la șoarecii de control, cât și la șoarecii iFXR-KO, deși reglarea descendentă a Cyp7A1 nu a atins semnificația statistică la șoarecii WT.

Am observat o ușoară scădere constantă a greutății corporale la șoarecii iFXR-KO (

15%), care nu au fost menționate de Kim și colab. 16 Deoarece nu s-au găsit diferențe în ceea ce privește aportul de alimente sau conținutul de energie în materii fecale (datele nu sunt prezentate), este probabil ca aceasta să reflecte modificările consumului de energie la șoarecii iFXR-KO. Această consecință neașteptată a deficienței iFXR este în prezent investigată.

Este bine cunoscut faptul că expresia hepatică Cyp7A1 prezintă un ritm diurn marcat. S-a arătat că expresia a 3, 13, 23 Cyp7A1 a crescut exclusiv la șoarecii iFXR-KO în perioada nocturnă activă, când expresia Fgf15 este ridicată la șoarecii WT. Deoarece nu s-au observat diferențe între cele două grupuri în expresia Fxr hepatic și Shp, această creștere a Cyp7A1 la șoarecii iFXR-KO este atribuită acestor șoareci care exprimă Fgf15 cu un intestin intestinal scăzut, ceea ce este o consecință directă a deficitului de FXR intestinal, după cum a confirmat. examinarea expresiei intestinale Ibabp. Concluzionăm că FXR intestinal prin Fgf15 reglează sinteza acidului biliar în principal pe timp de noapte, ceea ce este în concordanță cu Houten și colab. 25, care au arătat că FXR intestinal este cel mai activ pe timpul nopții folosind șoarecele reporter luciferază FXR transgenică. 25

În ciuda efectului dependent de timp asupra expresiei Cyp7A1, șoarecii iFXR-KO arată o dimensiune globală crescută a bazinelor de acid colic. Ca rezultat, secreția de acid biliar a fost crescută, ceea ce, la rândul său, a dus la creșterea fluxului biliar și la producția de fosfolipide. Acest lucru este în concordanță cu rezultatele lui Yu și colab. Acești autori au raportat că șoarecii cu deficit de Fgfr4, adică fără semnalizare hepatică Fgf15, au arătat, de asemenea, o dimensiune crescută a bazinelor de acid biliar și o rată mai mare de secreție de acid biliar hepatobiliar decât martorii lor.

După hrănirea unei diete ușoare îmbogățite cu acid biliar, secreția de acid biliar a crescut în ambele grupuri, asociată cu o secreție crescută de fosfolipide și colesterol. Deoarece FXR intestinal este afectat la șoarecii iFXR-KO, nu ne-am așteptat la o scădere a expresiei hepatice Cyp7A1 la acești șoareci. Cu toate acestea, o creștere a acizilor biliari a dus la o reglare descendentă a Cyp7A1, care nu a atins semnificația statistică la șoareci WT și Cyp8B1 în ambele genotipuri. O mică creștere a expresiei ileale Fgf15 în combinație cu o creștere a expresiei hepatice Shp poate explica scăderea observată a expresiei Cyp7A1 la șoarecii iFXR-KO. Mai important, majoritatea diferențelor dintre cele două tulpini observate în formarea bilei au fost reduse la minimum, ceea ce înseamnă că o creștere destul de ușoară a fluxului de acid biliar prin ficat (+ 30%) are prioritate asupra rolului de reglare al Fgf15 intestinal.

După sechestrarea acidului biliar în tractul intestinal, secreția de acid biliar a scăzut în ambele grupuri, ducând la scăderea fluxului biliar și fosfolipidic și a secreției de colesterol. În concordanță cu dieta îmbogățită cu TCA, majoritatea diferențelor observate între cele două tulpini în starea de hrănire au fost reduse la minimum. La nivelul expresiei genice, sechestrarea acidului biliar a provocat o scădere a expresiei intestinale a Fgf15, ducând la creșterea nivelului de mARN al cyp7A1 și Cyp8B1 în ficat. Cu toate acestea, la șoareci WT, contribuția scăderii expresiei hepatice Shp nu poate fi exclusă .

Studiul nostru arată că producția de Fgf15 mediat de FXR intestinal contribuie la sinteza acidului biliar, în special pe întuneric, când activitatea FXR intestinală este mare. Perturbarea FXR intestinale are ca rezultat o dimensiune crescută a rezervorului de acid colic, ducând la creșterea secreției de acid biliar și, astfel, la creșterea excreției de bilă și fosfolipide. Modularea depozitelor de acid biliar prin suplimentarea sau sechestrarea acizilor biliari în tractul intestinal minimizează rolul semnalizării intestinale FXR-Fgf15 prezente în condiții dietetice normale.