programare

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Rezultatul
  • Agenți de semnalizare a insulinei în țesutul ventricular stâng
  • Mediatori ai hipertrofiei ventriculare stângi (LVH) și stresului
  • Expresia receptorului de steroizi
  • Rezultate histologie
  • discuţie
  • Material si metode
  • Izolarea reacției în lanț a ARN-ului și a polimerazei în timp real
  • Western Blot
  • Analiza histopatologică
  • histomorfometrie
  • analize statistice
  • Mai multe detalii
  • Informatii suplimentare
  • Documente Word
  • Informatii suplimentare
  • Comentarii

obiecte

  • Biologie cardiovasculară
  • Modelul bolii

abstract

În hipertrofia cardiacă 23, 24, au fost implicați mai mulți mediatori moleculari implicați în semnalizarea insulinei, cum ar fi fosfatidil inozitol-3 kinaza (PI3K)/proteina kinaza B (AKT)/ținta mamiferelor a căii de semnalizare a complexului de rapamicină 1 (mTORC1). Dovezile studiilor in vitro 25 sugerează că T declanșează hipertrofia cardiacă prin activarea căii mTORC1. Deoarece T prenatal induce hiperandrogenism funcțional și rezistență la insulină la ovinele 4, 18, modifică semnalizarea insulinei în ficat și mușchi 26 și atât T cât și insulina au potențialul de a modifica funcția cardiacă, am emis ipoteza că excesul prenatal de T perturbă și semnalizarea insulinei și crește reglarea insulinei. markeri moleculari ai hipertrofiei cardiace care duc la remodelare cardiacă adversă.

Rezultatul

Greutatea corporală (kg; medie ± SEM) nu a diferit între ovine martor și ovine tratate cu T în momentul colectării (69, 4 ± 5, 4 tratate cu T versus 63, 09 ± 4, 9 p = 0,40, coeziune d = 0, 44). Nivelurile de insulină la jeun (UI/ml; medie ± SEM) la femeile tratate cu T prenatal au avut tendința de a fi mai mari (tratate cu T 15, 7 ± 4, 7 față de controlul 9, 23 ± 2, 12, p = 0,26), cu Cohens analiza a relevat o ușoară creștere (d) = 0,65). Nivelurile de glucoză la jeun (mg/dl; medie ± SEM) au fost în medie de 58 ± 3, 9 și 52 ± 1,7 pentru femeile tratate cu T și respectiv pentru martori (p = 0,28), analiza Cohens relevând o ușoară diferență de mărime. d = 0,67)., Raportul insulină la glucoză a avut, de asemenea, tendința de a fi mai mare în grupul tratat cu T (0,25 ± 0,06), comparativ cu grupul martor (0,17 ± 0,04), cu analize ale lui Cohen a arătat o ușoară creștere (d = 0,60) . Greutățile ventriculare stângi ale femeilor tratate cu T au avut tendința de a fi mai mari, dar nu au diferit statistic de ovinele martor (tratate cu T 164,9 ± 9,9 grame față de martorii 152 ± 7,2 grame, p = 0,30, coeziune d = 0, 54).

Agenți de semnalizare a insulinei în țesutul ventricular stâng

O creștere semnificativă a expresiei genetice a proteinelor implicate în calea de semnalizare a insulinei a fost găsită în ventriculul stâng la femeile tratate cu T prenatal, comparativ cu martorii. Excesul prenatal T a crescut nivelul de expresie al IRS-1 cu 6,4 ori (p = 0,027), PI3K de 8,5 ori (p = 0,04) și AKT cu 27 de ori (p = 0,06) comparativ cu controlul (Fig. 1).

Două teste t cu coadă au fost folosite pentru a testa diferențele dintre grupurile tratate cu T și cele de control și * p a primit un număr de ap de 0,06. Analiza dimensiunii efectului lui Cohen a relevat diferențe mari între grupurile tratate cu T și grupele de control pentru genele implicate în semnalizarea insulinei. . benzi (Cohen's d: AKT = 1,11, IRS-1 = 1,33, PI3K = 1,29, GSK3b = 0,452). Abrevieri: substrat 1 al receptorului de insulină IRS-1, PI3K fosfoinozidă 3-kinază, Akt protein kinază B, GSK3B Glicogen sintază kinază 3 beta.

Imagine la dimensiune completă

În condițiile inițiale, expresia proteinei PI3K (subunitatea p85) în ventriculul stâng a fost semnificativ diferită (p = 0,01) între T tratată prenatal (0,023 ± 0,01) și femeile martor (0,019 ± 0,001); și pPI3K a fost, de asemenea, crescut (p = 0,008) în T tratată prenatal (0,01 ± 0,005) comparativ cu martorul (0,008 ± 0,006). Raportul pPI3K/PI3K nu a fost semnificativ statistic între grupuri (tratament prenatal T: 0,5 ± 0,03 vs control: 0,45 ± 0,05, p = 0,55). AKT total (T prenatal: 0, 40 ± 0, 03 vs control 0, 26 ± 0, 02; p = 0, 007) și pAKT (T prenatal: 0, 26 ± 0, 03 vs control: 0, 18 ± 0, 02; p = 0,028) au fost semnificativ crescute la femeile tratate cu T prenatal comparativ cu martorul. Raportul pAKT/AKT (tratament prenatal T: 0,65 ± 0,05; comparativ cu controlul: 0,69 ± 0,04) nu a fost diferit statistic între cele două grupuri (p = 0,57). Nu am văzut nicio diferență în nivelurile de proteine ​​ale transportorului de glucoză 4 (GLUT 4) între prenatal tratat cu T și control (p = 0,33, Fig. 2).

Pentru a testa diferența dintre probele tratate cu T și cele de control, s-a folosit un dublu test t Student și * p a fost atribuit la 25, 27 T in vitro, găsit în ventriculul stâng la femeile tratate prenatal cu T comparativ cu controlul ( p = 0,002). (Fig. 3) și expresia proteinei sale au fost, de asemenea, crescute în ventriculul stâng (mTOR total: prenatal T 0, 16 ± 0,02 față de control 0,11 ± 0,01, p = 0,04; 0,008 vs control 0,056 ± 0,004; p = 0,01) (Fig. 4). GSK3β, o importantă țintă din aval de AKT în inimă care contribuie la suprimarea creșterii hipertrofice 28, a diferit între cele două grupuri. GSK3 beta total a fost semnificativ crescut (p = 0,04) la femeile tratate prenatal (6,1 ± 0,57) comparativ cu martorul (4,5 ± 0,4); în timp ce p-GSK3 beta nu a diferit (p = 0,16) între grupurile T tratate prenatal (1,99 ± 0,22) și grupurile de control (1,56 ± 0,15). Raportul p-GSK 3 beta/GSK3beta a fost semnificativ mai mic (p = 0,002) la femeile tratate prenatal cu T (0,32 ± 0,008) comparativ cu martorii (0,35 ± 0,05) (Fig. 4).

Două teste t cu coadă a * la p # pentru p 0,06 au fost folosite pentru a testa diferența dintre grupurile tratate cu T. și analiza mărimii efectului lui Cohen a relevat diferențe moderate până la mari între grupurile tratate cu T și grupurile de control pentru genele implicate în căi de semnalizare.insulină (Cohen's d: mTORC1 = 1,89, aMHC = 1, 20, ßMHC = 0, 89, mTORC1 = 1, 89, BNP = 1, 34, ANP = 0, 61, NFATc3 = 1, 46). Abrevieri: mTORC1 Mammalian target of rapamicin 1 complex, MHC myosin heavy chain, BNP brain naturetic peptide, ANP atrial naturetic peptide, NFATc3 factor nuclear activate cell T.

Imagine la dimensiune completă

Pentru a testa diferența dintre probele tratate cu T și cele de control, s-a folosit un test dublu Student și s-a atribuit p 29. T prenatală a crescut expresia genei NFATc3 de 3,5 ori peste control (p = 0,02, Fig. 3). Măsurătorile BNP și ANP, markeri ai hipertrofiei cardiace eliberate ca răspuns la tulpina peretelui cardiac, au arătat că BNP a fost crescut de 8,2 ori în grupul tratat cu T prenatal, comparativ cu martorii (p = 0,01, Fig. 3), în timp ce nivelurile de ANP nu a diferit între grupuri (schimbarea pliurilor 1, 64: p = 0,28).

aMHC, o proteină miofilamentară rozătoare dominantă care s-a dovedit a fi modificată în modelele de rozătoare cu hipertrofie cardiacă 30, 31, 32, a fost crescută de 2-3 ori în grupul prenatal tratat cu T comparativ cu martorii (p = 0,046) (Fig. 3)., Spre deosebire de ßMHC, proteina miofilament dominantă în ventriculul stâng 33 al omului adult nu a diferit semnificativ (schimbarea pliului 2, 2: p = 0, 10) între cele două grupuri.

Expresia receptorului de steroizi

Deși receptorii de androgeni și estrogeni au fost exprimați în țesutul de oaie ventricular stâng, tratamentul prenatal T nu a modificat în mod semnificativ expresia genei receptorilor de androgeni sau a receptorilor de estrogen beta sau alfa (modificarea AR fold 0,88 p = 0,40, modificarea ER beta fold 2,2: 2: p = 0, 17, modificări multiple ER alfa 1, 5: p = 0, 64, Figura 5).

Amploarea efectului Cohen a constatat mici diferențe între grupurile tratate cu T și grupurile martor în expresia genică a receptorilor androgeni și estrogeni (AR = 0, 2, ER alfa 0, 26 și ER beta 0, 77) Abrevieri: receptor AR androgen, Receptor de estrogen ER.

Imagine la dimensiune completă

Rezultate histologie

5 din 8 femei tratate cu T prenatal au avut dezordine miocardică focală în ventriculul stâng la H&E și colorare Masson comparativ cu martorii care nu au avut dovezi de dezarctare miocardică (Figura 6a). Tratamentul prenatal T a mărit dimensiunea cardiomiocitelor comparativ cu martorul (T tratat 15,1 ± 0,4 μm față de 13,6 ± 0,4 μm, p = 0,02) (Figura 6b).

( A ) Secțiuni histologice reprezentative ale secțiunilor H&E din țesutul ventricular stâng de la ovine prenatale în vârstă de doi ani tratate cu T (A) și martor (B). ( B ) Efectul tratamentului T prenatal asupra mediei cardiomiocitare medii. * Indică o valoare p de 18, 22. Aceste tulburări ale semnalizării moleculare ar putea duce la o susceptibilitate crescută la afectarea inimii.

mTORC1 este unul dintre regulatorii cheie ai sintezei proteinelor în cardiomiocite și activarea acestuia duce la hipertrofie cardiacă 41, 42. Poate fi activat de factori de creștere, inclusiv insulină, prin calea sa de semnalizare, precum și de T 25, 43. Activarea proteinelor în aval de receptorul de insulină (PI3K/AKT/mTORC1) este asociată cu „hipertrofia fiziologică” în inimă, dar există și dovezi ale hipertrofiei „patologice” cu activarea cronică a acestei căi 44, 45, 46, 47, 48, ducând la întreruperea creșterii țesuturilor coordonate și angiogeneză. Constatările din acest studiu, care arată o expresie crescută a mTORC1, PI3K și AKT, sugerează că excesul prenatal de T poate fi baza activării căii de semnalizare a insulinei cardiace, ducând la activarea mTORC1, ceea ce duce în cele din urmă la hipertrofie cardiacă. Creșterea expresiei genetice a BNP și NFATc3, ambii markeri ai hipertrofiei patologice, indică hipertrofia dezadaptativă.

Deoarece excesul prenatal de T duce la hiperinsulinemie maternă 49 și rezistență postnatală la insulină 18 la descendenți, este probabil ca hiperinsulinemia maternă să poată fi, de asemenea, un jucător major în programarea hipertrofiei cardiace induse de T prenatală la descendenți. De exemplu, o creștere a semnalizării PI3K/AKT/mTORC1 este observată la nou-născuții cu hiperinsulinemie congenitală 50, 51. În mod similar, s-a demonstrat că hiperinsulinemia fetală datorată obezității materne duce la tulburări de programare cardiacă la descendenți, cu markeri crescuți ai hipertrofiei ventriculare stângi și o creștere a AKT, precum și a mTOR 52 .

În timp ce T poate duce la hipertrofie cardiacă indirect prin programarea hiperinsulinemiei, potențialul efectelor directe ale androgenului asupra hipertrofiei cardiace nu poate fi ignorat. Aceste animale sunt hiperandrogen funcțional și prezintă o expresie AR crescută la nivelul hipotalamusului 53, glandei pituitare (Cordoso și Padmanabhan, nepublicat) și ovarelor 54. Cardiomiopatia a fost observată la nou-născuții cu hiperplazie suprarenală congenitală 55, o afecțiune în care fătul este expus la androgeni endogeni excesivi. Receptorii de androgeni și estrogeni sunt prezenți în țesutul cardiac atât în ​​citosol, cât și în nucleul 19. Legarea hormonilor sexuali de receptorii lor s-a dovedit a duce la efecte genomice și non-genomice asupra inimii și un mecanism este activarea căii PI3K/AKT 19, ceea ce duce la activarea în aval a mTORC1, ducând la o sinteză crescută a proteinelor și în cele din urmă hipertrofia cardiacă 24. În timp ce receptorii androgeni sunt exprimați în ventriculul stâng pentru a facilita efectele directe ale T, absența modificărilor în expresia AR la femeile tratate cu T prenatal sugerează că orice efecte directe ale T pot fi mediate de creșterea ligandului (tratamentul T), mai degrabă decât de receptor.

S-a constatat că T crește absorbția de glucoză cardiomiocitară prin creșterea translocației GLUT4 56 și, deși nu s-a observat o creștere a expresiei proteinei GLUT 4 în ventriculul stâng în condiții bazale, expresia crescută a proteinelor de semnalizare a insulinei, inclusiv IRS-1, PI3K și AKT, sugerează creșterea ventriculului stâng metabolismul glucozei. Acizii grași liberi sunt combustibilul principal pentru producerea de energie în țesutul cardiac, dar în timpul vieții fetale și al stresului, inima revine la glucoză ca sursă principală de combustibil 57. Creșterea expresiei genice a proteinelor implicate în absorbția glucozei la femelele prenatale T poate indica un răspuns adaptativ la creșterea cererii metabolice pe inimă, deoarece vedem și expresia crescută a BNP, un marker al stresului cardiac. Creșterea expresiei mTORC1 sugerează că T ar putea duce la hipertrofie cardiacă printr-o creștere a mTORC1, așa cum sa sugerat deja 25 .

Dintr-o perspectivă translațională, aceste descoperiri pot fi relevante pentru descendenții femeilor cu SOP. Nivelul de androgen și insulină s-a dovedit a fi crescut la femeile gravide cu PCOS 67, 68 și există dovezi că cohortele spaniole dau naștere copiilor cu greutate redusă la naștere 69. Puii de sex feminin ai mamelor PCOS au tulburări metabolice precoce 70 similare cu cele observate în modelul nostru prenatal T18, sugerând că, similar modelului prenatal T-oaie, prezența hiperandrogenismului la femeile cu PCOS are potențialul de a programa negativ mai multe sisteme de organe, inclusiv sistemul cardiovascular.în urmașii lor.

Pe scurt, constatările acestui studiu oferă dovezi pentru reprogramarea cardiacă într-un model de ovine de SOP. Studiile suplimentare care elucidează consecințele funcționale ale acestor modificări sunt vitale și ne vor îmbunătăți înțelegerea impactului excesului de T prenatal asupra sănătății inimii și vor contribui la dezvoltarea de noi strategii de tratament pentru a preveni susceptibilitatea cardiacă la insultele prenatale.

Material si metode

La aproximativ 2 ani, pentru a evita efectele diferitelor niveluri de steroizi endogeni, toate animalele au fost ovariectomizate și implantate cu o capsulă SILASTIC lungă de 1 cm (diametru interior 3,35 mm și diametru exterior 4,65 mm; Dow Corning Corp., Midland, MI ) încărcat cu 17β estradiol (estradiol; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA). Aproximativ o lună mai târziu, două implanturi interne de progesteron cu eliberare de medicamente (InterAG, Hamilton, Waikato, Noua Zeelandă) au fost inserate subcutanat în fiecare animal. Implanturile cu progesteron au fost îndepărtate 14 zile mai târziu și toate animalele au primit patru implanturi suplimentare de 3 cm lungime de estradiol pentru a atinge nivelurile de steroizi ovarieni detectate în timpul fazei foliculare târzii. Animalele au fost sacrificate

La 20 de ore de la inserarea implanturilor de estradiol în timpul fazei foliculare tardive anticipate a ciclului prin administrarea unei supradoze de barbiturice (Fatal Plus, Vortech Pharmaceuticals, Dearborn, MI). Inimile au fost recoltate și porțiuni din ventriculele drept și stâng au fost înghețate rapid și depozitate la -80 ° C până la procesare sau formalină stabilizată pentru procesare histologică. Insulina plasmatică și glucoza au fost măsurate înainte de eutanasie după 48 de ore de post. Concentrațiile de insulină au fost determinate prin radioimunotest (Insulin RIA Kit, MP Biomedicals). Sensibilitatea testului de insulină a fost de 3,0 μU/l. Concentrațiile de glucoză au fost determinate prin metoda glucozei oxidazei (Pointe Scientific Inc.). CV-urile inter-și intra-test pentru testele de insulină și glucoză au fost eficiente la 90%. Grundurile specifice genei au fost proiectate folosind software-ul de selectare a grundului și sunt descrise în detaliu în materialul suplimentar din tabelul 1.

Testul SYBR Green PCR în timp real a fost efectuat folosind ADNc generat. Un control negativ cu transcriptază inversă a fost efectuat pe fiecare probă pentru a exclude contaminarea ARN-ului izolat cu ADN genomic. Reacțiile cantitative RT PCR au fost efectuate pe un instrument PCR în timp real aplicat Biosystem 7200 și au fost efectuate în triplicat. Rezultatele testului au fost cuantificate utilizând valorile ciclului de prag (CT) ale fiecărei probe. Valorile CT ale fiecărei gene de interes au fost comparate cu valorile genei casnice, gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază (GAPDH). Doar valorile mai mici de 35 au fost considerate pozitive. Rezultatele fiecărui test au fost verificate prin repetarea rezultatului în al doilea test.

Western Blot

Analiza histopatologică

Țesuturile ventriculare stângi au fost fixate în formaldehidă în PBS pH 7, 4. Țesutul a fost apoi deshidratat cu alcooli în serie, purificat în xilene și încorporat în parafină. Secțiuni de parafină groase de 5 μm au fost tăiate și colorate cu hematoxilină și eozină (H&E) pentru analiza aspectului dur. Periodatul de hematoxilină colorată cu contrast (PAS-H) a fost utilizat pentru a facilita cuantificarea dimensiunii cardiomiocitelor folosind laboratorul nostru de cercetare histopatologică de la Universitatea de Stat din Michigan. Secțiunile histologice au fost examinate în ordine aleatorie de către doi patologi veterinari independenți care erau orbi de grupurile de tratament.

histomorfometrie

Conform protocoalelor stabilite anterior, 73, 74 de diametre medii ale cardiomiocitelor ventriculare stângi au fost determinate prin măsurarea axei scurte a 100 de cardiomiocite într-o secțiune transversală nucleară cu profiluri capilare aproape circulare în 10 câmpuri microscopice selectate aleatoriu la o mărire de 400x. Măsurătorile au fost obținute utilizând software-ul CellSens.

analize statistice

Mai multe detalii

Cum se citează acest articol: Vyas, AK și colab. Programare prenatală: programare cardiacă nedorită din cauza excesului de testosteron gestațional. Știință. reprezentant. 6, 28335; doi: 10, 1038/srep28335 (2016).

Informatii suplimentare

Documente Word

Informatii suplimentare

Comentarii

Prin trimiterea unui comentariu, sunteți de acord să respectați Termenii și condițiile și Regulile comunității. Dacă găsiți ceva jignitor sau nu respectați termenii sau liniile directoare, marcați-l ca fiind nepotrivit.