ușor

  • obiecte
  • abstract
  • FUNDAL:
  • SCOPUL:
  • metodologie:
  • rezultatele:
  • concluzie:
  • introducere
  • Materiale și metode
  • fiară
  • dietă
  • Protocol experimental
  • Conținutul de proteine ​​tisulare și măsurători biochimice
  • Măsurători de izotopi
  • Expresia genelor
  • statistici
  • Rezultatul
  • Aportul de alimente, creșterea animalelor și compoziția corpului
  • Uree plasmatică, hormoni și aminoacizi
  • Compoziția țesuturilor, rata de sinteză a proteinelor și expresia genică a căii proteolitice
  • discuţie
  • Informatii suplimentare
  • Documente Word
  • Informatii suplimentare

obiecte

  • metabolism
  • Obezitatea
  • proteoliză

abstract

FUNDAL:

Dietele bogate în proteine ​​(HP) în timpul restricționării energiei au fost studiate pe larg pentru capacitatea lor de a reduce grăsimea corporală și de a menține masa corporală slabă, dar se știe puțin despre efectele lor asupra metabolismului proteinelor în țesuturile slabe.

Pentru a determina efectul restricției energetice și al aportului de proteine ​​asupra anabolismului și catabolismului proteinelor la șobolani.

metodologie:

Timp de 5 săptămâni, 56 de șobolani masculi Wistar au fost hrăniți cu o dietă care induce obezitatea (OI). Au fost apoi supuși unei restricții de energie de 40% folosind o dietă OI sau o dietă echilibrată HP timp de 3 săptămâni, în timp ce grupul de control a fost hrănit cu o dietă OI ad libitum (n = 8 per grup). Șobolanii cu restricție HP au fost împărțiți în cinci grupuri care diferă doar în ceea ce privește sursa de proteine: proteine ​​totale din lapte, cazeină (C), zer (W), un amestec de 50% C și W și soia (n = 8). Animalele au fost apoi sacrificate în starea postprandială și s-a determinat compoziția corpului lor. Rata de sinteză a proteinelor a fost determinată în ficat, stomac și rinichi folosind o doză subcutanată de valină 13 C. Nivelurile de MRNA au fost măsurate pentru enzimele cheie implicate în cele trei căi de proteoliză.

rezultatele:

Restricțiile energetice, dar nu compoziția dietei, au afectat pierderea în greutate și adipozitatea, în timp ce greutatea țesutului slab (cu excepția rinichilor) nu a fost afectată de compoziția dietei. Nivelurile de aminoacizi neoglucogeni au avut tendința de a scădea sub limita energetică (P 1, 2 includ diferite niveluri de restricție energetică și modificarea conținutului energetic al nutrienților din dietă, precum reducerea consumului de grăsimi sau carbohidrați (CHO) și creșterea proteinelor Studiul 3, 4 datorită efectului lor saturant, care ar putea reduce aportul de energie 5 și ar putea crește respectarea de către pacienți a dietei.6, 7 În plus, o dietă bogată în proteine ​​poate reduce la minimum pierderea de masă musculară observată cu un conținut scăzut de calorii. Tipul de sursă de proteine ​​poate avea, de asemenea, efectul raportat la modelele de rozătoare. 10, 11

Efectele restricției energetice asupra fluxurilor anabolice și catabolice nu sunt suficient cunoscute, iar constatările disponibile, care diferă în raport cu mulți parametri (model, durată, grad de restricție), nu sunt comparabile. Un studiu efectuat la om a arătat recent că sinteza proteinelor musculare a fost redusă după o ușoară reducere a energiei. 12 Au fost obținute date suplimentare la șobolani și au evidențiat efecte adverse ale restricției energetice asupra anabolismului proteinelor musculare, în funcție de tipul muscular (soleus, gastrocnemius, plantaris, tibialis anterior) și proteine ​​(sarcoplasmice sau mitocondriale). 13, 14, 15 În plus, anabolismul proteinelor nu a fost studiat în alte organe, cum ar fi ficatul sau rinichii, în timp ce ad libitum a observat că sinteza proteinelor în ficat și rinichi a fost modulată de nivelurile de proteine ​​din dietă, spre deosebire de sinteza musculară. . 16, 17 Studiile privind efectul restricției energetice asupra proteolizei sunt rare și, spre deosebire de studiile privind sinteza proteinelor, au implicat ficatul 18, 19, dar nici mușchiul, nici rinichii. Prin urmare, pare necesar să se clarifice consecințele restricției energetice asupra fluxurilor de proteine ​​în funcție de compoziția dietetică și, în special, a conținutului său de proteine.

Scopul acestui studiu a fost de a înțelege mai bine efectele compoziției dietetice a macronutrienților, inclusiv sursa de proteine, asupra compoziției corpului și a metabolismului proteinelor tisulare în timpul restricționării energiei la șobolani.

Materiale și metode

Toate experimentele au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare ale Comitetului francez pentru îngrijirea animalelor și ale Convenției europene cu animale vertebrate utilizate pentru experimente. Șobolani Wistar masculi (n = 56, 300-320 g) au fost cumpărați de la Harlan (Horst, Olanda) și adăpostiți în condiții de mediu controlate (temperatură, perioadă întunecată de 12 ore începând cu ora 08:30). Șobolanii au avut acces gratuit la apă și la chow de laborator comercial timp de 5 zile înainte de începerea adaptării dietetice la dieta experimentală.

dietă

Un total de 56 de șobolani au fost hrăniți cu o dietă care induce obezitatea (OI) ad libitum timp de 5 săptămâni (12% energie ca proteină, 43% ca CHO, 44% ca grăsime) și apoi împărțiți în șapte grupuri diferite timp de 3 săptămâni (n = 8 pe grup). Grupul de control a fost ținut pe aceeași dietă ad libitum timp de 3 săptămâni. Șobolanii OI-R au primit o dietă OI cu o restricție energetică de 45%, în timp ce alți șobolani au avut o restricție energetică cu o dietă bogată în proteine ​​(HP-R) (33% energie ca proteină, 37% ca CHO și 30% ca grăsime). Cinci surse de proteine ​​diferite au fost testate la șobolanii HP-R: proteine ​​din lapte (MP), zer (W), cazeină (C), un amestec de C și W în același raport (CW) și soia (S). Energia furnizată în grupul restricționat a fost calculată pentru a furniza 55% din aportul mediu de energie observat în ultimele 2 săptămâni de inducție. Informații suplimentare despre proiectul studiului sunt disponibile pe site-ul web Int J Obes (Figura S1). MP total a fost sursa de proteine ​​dietetice IO și IO-R (Tabelul 1). În ceea ce privește compoziția, dietele HP-R au fost reprezentative pentru dietele de slăbit utilizate în mod obișnuit la om. Dietele OI-R și HP-R au fost completate cu minerale și vitamine pentru a evita deficiențele datorate restricției de energie.

Tabel în dimensiune completă

Dietele au fost furnizate în formă semi-lichidă pentru a preveni scurgerea și pentru a îmbunătăți înregistrarea aporturilor. În ultima săptămână a perioadei de restricție, șobolanii au fost obișnuiți cu hrana conform unui model constând dintr-o primă perioadă între 8:30 și 9:30 care livrează 1/3 din doza zilnică și o a doua perioadă între 12:00 și 18: 00 eliberând doza rămasă. Șobolanii OI au fost supuși aceluiași program, dar au avut acces gratuit la alimente între orele 12:00 și 18:00. Acest model a fost adoptat astfel încât animalele obișnuiau să mănânce complet o masă standard în decurs de 1 oră în ziua experimentală.

Protocol experimental

Greutatea corporală și aportul alimentar al șobolanilor au fost măsurate zilnic în primele 3 zile și apoi la fiecare 2 zile. În ziua 56, șobolanii au fost hrăniți cu o masă calibrată corespunzătoare 1/3 din doza zilnică cu 2 ore înainte de sacrificiu. Pentru a măsura rata de sinteză a fracției de proteine ​​(FSR), animalele au fost injectate subcutanat cu 300 μmol kg-1 BW dintr-o doză de inundație de L- (1-13C) -valină (50% mol., Cambridge Isotope Laboratories, Andover, MA minute înainte de ucidere. Animalele au fost anesteziate prin injecție intraperitoneală de pentobarbital de sodiu (50 mg kg-1 greutate corporală). După incizia abdomenului, sângele a fost extras din vena cavă în tuburi EDTA umplute și centrifugat pentru a măsura metaboliții și hormonii plasmatici. Șobolanii sunt apoi sacrificați prin ruperea venei cave caudale și a aortei. În condiții sterile, ficatul, rinichii și mușchii stomacului au fost îndepărtați, clătiți, cântăriți și înghețați până la analiză. Splina, mușchiul splinei, intestinul și stomacul au fost, de asemenea, luate în considerare. Plăcuțele de grăsime abdominală (epididimale, mezenterice și retroperitoneale) au fost excizate și plăcuța de grăsime subcutanată inghinală a fost îndepărtată. Carcasa a fost îndepărtată pentru a evalua masa corporală slabă. S-a înregistrat greutatea tuturor acestor țesuturi.

Conținutul de proteine ​​tisulare și măsurători biochimice

Țesuturile au fost liofilizate și cântărite. Conținutul lor total de N a fost determinat prin metoda Dumas utilizând un analizor elementar (Euro Elemental Analyzer 3000, EuroVector, Milano, Italia) cu atropină ca standard.

Conținutul total de proteine ​​(g) din țesuturi a fost determinat ca P = TM x% DM x% N x 6, 25/10.000, unde TM este greutatea umedă a țesutului (g) și DM în substanța uscată.

Concentrațiile plasmatice de aminoacizi au fost determinate pe probe de plasmă deproteinizată utilizând cromatografie cu schimb de ioni cu derivatizare de nynhidrin pe coloană (Biotech Instrument, St Quentin-en-Yvelines, Franța). Concentrațiile de insulină și leptină au fost analizate folosind un panou endocrin de șobolan (RENDO, Linco Research, Saint Charles, MI, SUA) într-un sistem Bioplex 200 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, SUA). Concentrațiile de uree au fost determinate folosind un kit comercial (Bio-Mérieux, Marcy l'Etoile, Franța).

Măsurători de izotopi

FSR (% pe zi) al proteinelor tisulare a fost calculat ca FSR = Ebound val/(Efree val × t) x 100, unde Ebound val și Efree val sunt legături proteice și au îmbogățit 13 C-valine în țesuturi. Ratele de sinteză absolută (ASR, g pe zi) au fost calculate ca ASR = FSR x P, unde P este conținutul total de proteine ​​din țesut. Masa musculară totală a fost estimată la 45% din greutatea corporală. 20

Expresia genelor

ARN-ul total a fost extras din țesutul înghețat folosind reactivi TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA). Concentrația totală de ARN a fost cuantificată la 260 nm și s-a folosit colorarea cu bromură de etidiu pentru a confirma integritatea ARN. Prima sinteză a ADN-ului complementar catenar (ADNc) a fost efectuată pe 400 ng ARN folosind un kit de transcripție inversă (Applied Biosystems, Courtaboeuf, Les Ulis, Franța) cu un ciclotermic PTC-200 (cercetare MJ, Waltham, MA, SUA). PCR în timp real a fost efectuat folosind un „mix master master PCR verde” (Applied Biosystems) pe un sistem PCR în timp real 7300 (Applied Biosystems). Grundurile au fost proiectate folosind software-ul Oligo Explorer 1.1.0 (GeneLink, Hawthorne, NY, SUA). Secvențele primerilor PCR utilizate au fost: 5'-ACACTGGCTCCTCAACCTG-3 '(înainte) și 5'-TCCACCTTGATACCTCCTAAG-3' (altfel) pentru catepsina D (NM_134334), 5'-CGCACCCTCTGACTACA-3 '(invers) și 5' - GCCCTCTTTATCCTGGATCT-3 '(revers) pentru ubiquitin (ubb, NM_138895), 5'-GGAAAACAAACGGGAGTATG-3' (înainte) și 5'-ACACAACGACGATGGAAAG-3 '(revers) forAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG -GAAGTAGAAGAAGGAGGTCG-3' (revers) pentru m-calpaine (NM_017116), 5'-GGGAGCCTGAGAAACGGC-3 'și 5'-GGGTCGGGGGGTG-3' pentru 18S.

Toate reacțiile PCR au fost efectuate după cum urmează: denaturarea la 95 ° C timp de 10 minute, 40 de cicluri de amplificare, fiecare ciclu constând din 15 s la 95 ° C și apoi 1 min la 60 ° C. Pragul ciclului (CC) pentru fiecare probă a fost determinat la un prag de fluorescență constant. Amplificări ale ARN ribosomal 18S au fost utilizate pentru a explica variabilitatea cantităților inițiale de ADNc și variațiile dintre plăci au fost corectate folosind un calibrator RT.

Expresia genică a fost determinată folosind formula 2-ACt, unde 2 reprezintă eficiența optimă a genei țintă PCR și ACt = Ct - Ct18S. Eficiența PCR a fost determinată în fiecare placă prin diluarea în serie a ARN transcris invers.

statistici

Datele sunt exprimate ca medie ± sd. Efectul grupului a fost analizat prin ANOVA unidirecțional (versiunea 9.1; SAS Institute Inc., Cary, NC, SUA) și s-au efectuat teste Tukey post-hoc pentru comparații multiple. Efectele restricției de energie și ale nivelului de proteine ​​au fost analizate folosind declarații de contrast în model în grupurile OI și grupurile restricționate. Efectul sursei de proteine ​​a fost analizat în grupurile HP-R. Pentru curbele de creștere, datele au fost analizate folosind un model mixt cu timpul ca factor de repetare. P

Creșterea șobolanilor în perioada de 5 săptămâni OI și în timpul restricției de energie timp de 3 săptămâni. Media ± sd (n = 8). Pentru o mai bună claritate, este listat un singur grup HP-R, deoarece nu există nicio diferență între grupurile restricționate. * diferă semnificativ de controale (model mixt cu măsuri repetate, testul post-hoc al lui Tukey). OI, șobolanii de control au fost hrăniți cu o dietă OI ad libitum; OI-R, șobolani cu energie limitată în dieta OI; HP-MP-R, șobolani cu consum redus de energie pe o dietă HP care conține MP total.

Imagine la dimensiune completă

Compoziția corpului a fost afectată de restricția energetică, în timp ce compoziția dietei macronutrienți (de exemplu, nivelul proteinei sau sursa de proteine) nu a avut niciun efect (Tabelul 2). Rinichii au fost singurul organ în care greutatea proteinelor a crescut semnificativ. Restricția de energie a redus tampoanele de grăsime, în timp ce țesuturile slabe au fost afectate doar marginal de restricția de energie. Nu a existat nicio diferență în compoziția corpului între diferitele grupuri restricționate, indiferent de nivelul și natura conținutului de proteine ​​din dieta lor.

Tabel în dimensiune completă

Uree plasmatică, hormoni și aminoacizi

Metaboliții și hormonii plasmatici au fost măsurați la 2 ore după masă (Tabelul 3). Uremia a fost cu 64% mai mare la șobolanii HP decât la șobolanii OI (P

Concentrațiile plasmatice de aminoacizi care au fost afectate de restricția de energie, nivelurile de proteine ​​și/sau sursa de proteine. Media ± sd (n = 8). OI, șobolanii de control au fost hrăniți cu o dietă OI ad libitum (linie neagră); OI-R, șobolani cu energie limitată în alimentele OI (bara albă); HP-R, șobolani cu restricție energetică sub o dietă HP (bare gri) cu proteine ​​din diverse surse (MP; W; CW; C; S). Principalele efecte statistice sunt prezentate în fiecare grafic: restricție de energie (ER), nivel de proteină (PL), sursă de proteină (PS).

Imagine la dimensiune completă

Compoziția țesuturilor, rata de sinteză a proteinelor și expresia genică a căii proteolitice

Conținutul de proteine, FSR și ASR din ficat, mușchiul gastrocnemius și rinichi sunt prezentate în Tabelul 4. Rezultatele pentru toate grupurile HP-R au fost reunite datorită absenței oricărui efect sursă de proteină. Restricția energetică și nivelul proteinelor nu au afectat conținutul de proteine ​​și fluxurile de sinteză a proteinelor în aceste țesuturi, după cum au fost evaluate de FSR sau ASR.

Tabel în dimensiune completă

În ficat, dieta nu a modulat expresia catepsinei D, ubiquitinei, enzimei E2 și m-Calpain (Figura 3). În schimb, nivelurile genelor de ARN implicate în căile proteolitice au fost crescute semnificativ prin restricția energetică în rinichi și scăzute cu nivelurile de proteine ​​în dietele cu restricții energetice pentru toate cele patru enzime. Efectul sursei de proteine ​​a fost observat și pentru ubiquitină, enzima E2 și M-calpain, cu o tendință la un nivel mai ridicat de expresie în grupul MP ​​comparativ cu Cas și S. În expresia genei proteolizei musculare gastrocnemius Enzime (cu excepția catepsinei D) au avut tendința de a crește odată cu restricția de energie, în timp ce nivelurile de HP au redus drastic expresia acestor patru enzime.

Expresia relativă a genelor căii proteolitice (catepsina D, ubiquitina, enzima E2, m-Calpain) în ficat, gastrocnemie și rinichi la șobolani după o restricție energetică de 3 săptămâni. Media ± sd (n = 8). OI, șobolanii de control au fost hrăniți cu o dietă OI ad libitum (linie neagră); OI-R, șobolani cu energie limitată în alimente OI (bara albă); HP-R, șobolani cu restricție energetică pe o dietă HP (bare gri) cu proteine ​​din diverse surse (MP; W; CW, amestec de C și W; C; S). Principalele efecte statistice sunt prezentate în fiecare grafic: grup, restricție de energie (ER), nivel de proteină (PL), sursă de proteină (PS).

Imagine la dimensiune completă

discuţie

Acest studiu a arătat că la șobolanii supuși unei restricții de energie de 40-45%, pierderea în greutate și compoziția corpului au fost afectate în principal de restricția de energie, în timp ce compoziția dietetică și sursa de proteine ​​nu au avut efecte semnificative. Nivelurile de HP au îmbunătățit glucoza circulantă și lipidele din sânge, în timp ce restricția de energie a fost redusă doar de acizii grași liberi. Nivelurile de HP au contracarat tendința de creștere a aminoacizilor neoglucogeni circulanți din cauza restricției de energie. Ratele de sinteză a proteinelor nu au fost afectate nici de restricția energetică, nici de nivelurile de proteine ​​dietetice, în timp ce la rinichi și mușchi, enzimele cheie ale proteolizei au fost supraexprimate cu restricție de energie și subexprimate pe măsură ce nivelurile de proteine ​​au crescut. Cu toate acestea, aceste modulații ale căilor proteolitice nu au afectat pierderea musculară, indiferent de conținutul de proteine ​​din dietă.

În concluzii, la șobolanii obezi adulți supuși unei restricții energetice de 40% timp de 3 săptămâni, greutatea și pierderea lor de grăsime au fost determinate doar de aportul caloric, independent de compoziția macronutrienților. Masa slabă a fost păstrată indiferent de nivelul proteinei, iar metabolismul proteinelor a fost doar ușor afectat, cu excepția căilor de proteoliză din mușchi și rinichi, unde orice activare postprandială prin restricție de energie a fost contracarată de un nivel HP. În cele din urmă, când nivelul de proteine ​​a fost ridicat, toate sursele de proteine ​​au fost echivalente în ceea ce privește efectele lor.