abstract

Terapia genică va deveni din ce în ce mai importantă în tratamentul tulburărilor congenitale sau dobândite, cum ar fi ateroscleroza și cancerul. Cu toate acestea, trebuie depășite obstacolele majore înainte ca așteptările să poată fi îndeplinite. Una dintre cele mai critice zone ale terapiei genetice este proiectarea unui vector genetic adecvat, precis și eficient care poate fi administrat în siguranță in vivo. 12455 În acest studiu, am investigat dacă ultrasunetele focalizate ar putea fi utilizate ca un instrument fizic pentru transfectarea celulelor cultivate. in vitro și în tumoră de prostată la șobolani Copenhaga in vivo .

Pentru acest studiu, am selectat ultrasunetele sinusale vizate pentru transfecția localizată, deoarece această metodă de aplicare a arătat cea mai mare rată de transfecție cu citotoxicitate mai mică in vitro. dimensiunea sa poate fi modificată.3031 În principiu, toate siturile țintă din corpul uman care pot fi accesate de dispozitive de diagnosticare cu ultrasunete clinice percutanate sau endoluminale. Dacă volumul țintă emite focalizare cu ultrasunete, acesta poate fi sonicizat cu expuneri multiple. Ecografia sinusoidală țintită nu este raportată pentru a media transfecția. O întrebare specială pentru această lucrare a fost de a investiga dacă ultrasunetele sinusale direcționate ar putea crește eficiența transfecției ADN plasmidice reporter la intensitatea și presiunea ultrasunetelor adecvate pentru aplicații non-invazive in vivo fără efecte secundare semnificative.

În acest scop, am optimizat mai întâi parametrii acustici în experimentele de cultură celulară acustică pentru a media transfecția genei raportoare β-galactozidază și luciferază în mai multe linii celulare (fibroblaste NIH 3T3, HeLa, adenocarcinom de prostată R3327-AT1 și melanom uman Mewo). Posibilitatea transfecției in vivo a fost apoi testată într-una din liniile celulare testate, adenocarcinomul de prostată R3327-AT1, care a fost transplantat la șobolani în Copenhaga. Colorarea citochimică a β-galactozidazei a fost efectuată după injectarea directă a plasmidei în tumoră și injectarea intravenoasă. Pentru a investiga în continuare capacitățile de transfecție in vivo ale ultrasunetelor, au fost efectuate ELISA pentru a cuantifica nivelurile de proteine ​​reporter β-galactozidază în tumorile de prostată după administrarea intratumorală și intravenoasă a genei reporter.

Rezultatul

Transfecția in vitro

În primul rând, au fost examinate capacitățile de transfecție in vitro ale ultrasunetelor focalizate. Flacoanele de reacție cu celule de carcinom de prostată (R3327-AT1) au fost amestecate cu o plasmidă reporter și expuse la un câmp ultrasonic într-un rezervor de apă pentru a asigura o cuplare ultrasonică simplă și optimă (Figura 1). Pentru a determina condițiile optime de transfecție cu ultrasunete, s-au utilizat 1 x 106 celule de cancer de prostată (R3327-AT1) și 1 μg ADN plasmidic raportor (β-galactozidază) în 500 μl PBS în fiecare soluție de 500 ml. Când probele de plasmidă au fost sonicate în mijlocul focalizării câmpului sonor, β-galactozidaza a fost puternic exprimată, indicând un transfer de ADN reușit. Am constatat o creștere a ratei de transfecție până la stimularea de 220 de ori cu creșterea amplitudinii presiunii de la 0,1 la 1 MPa, în timp ce procentul de celule viabile a scăzut cu amplitudini de presiune mai mari la 5% la 5 MPa (Figura 2). Cel mai bun raport în termeni de stimulare ridicată și viabilitate ridicată a celulelor a fost atins la 1 MPa cu 80% viabilitate. Această presiune a fost aplicată în următoarele experimente pe măsură ce timpul de sonicare a variat. Odată cu creșterea timpului de sonicare, rata de stimulare a crescut la 3 minute, în timp ce viabilitatea celulară a scăzut semnificativ (Figura 3).

vitro

Schema unui dispozitiv de sonicare. Ecografia focalizată a fost generată de un senzor de disc piezoelectric de 10 cm, focalizat de o lentilă din polistiren (distanță focală, f = 126 mm) și conectat la un rezervor de apă de 40 l. Flacoanele de reacție care conțin celule amestecate cu ADN au fost plasate fie în, fie în afara focarului elipsoidal al câmpului sonor la temperatura camerei. Același echipament a fost folosit pentru experimentele in vivo. Șobolanii au fost reținuți într-un tub de plastic la un unghi de 45 ° și corpul lor inferior a fost scufundat într-un rezervor de apă, astfel încât tumorile din coapsă să poată fi sonicate sub apă pentru a îmbunătăți conexiunea cu ultrasunete. Pentru sonicare, centrul tumorilor a fost plasat în focarul geometric al câmpului sonor.

Imagine la dimensiune completă

Influența amplitudinii presiunii asupra stimulării și viabilității. Transfecția in vitro a plasmidei raportoare β-galactozidază în celulele tumorale de prostată Dunning, subliniul R3327-AT1 prin ultrasunete focalizată. Efectul amplitudinii presiunii asupra stimulării și viabilității normalizat la control determinat prin colorarea β-galactozidazei și colorarea cu albastru tripan (n = 4, medie ± se). Expresia genică a fost analizată la 24 de ore după sonicare. Stimularea pliurilor a fost calculată prin numărul de celule albastre împărțit la numărul de celule albastre din controalele nesonorizate. Viabilitatea celulară a fost analizată imediat după sonicare. Durata sonicării a fost de 3 minute, frecvența pulsului a fost de 100 Hz, lungimea impulsului a fost de 4 ms.

Imagine la dimensiune completă

Influența timpului de sonicare asupra stimulării și viabilității. Transfecția in vitro a plasmidei raportoare β-galactozidază în celulele tumorale de prostată Dunning, subliniul R3327-AT1. Efectul timpului de sonicare asupra stimulării și viabilității a fost normalizat la controlul determinat prin colorarea β-galactozidazei și colorarea cu albastru tripan (n = 4, medie ± se). Expresia genică a fost analizată la 24 de ore după sonicare. Stimularea pliurilor a fost calculată prin numărul de celule albastre împărțit la numărul de celule albastre din controalele nesonorizate. Viabilitatea celulară a fost analizată imediat după sonicare. Amplitudinea presiunii a fost de 1 MPa, frecvența impulsului a fost de 100 Hz, lungimea impulsului a fost de 4 ms.

Imagine la dimensiune completă

În schimb, am constatat că nici transferul de gene, nici moartea celulelor nu au fost crescute în comparație cu celulele de control comparativ cu celulele de control atunci când flacoanele cu ADN plasmidic au fost plasate în afara focarului câmpului sonor la amplitudini de presiune mai mici de 0,1 MPa. În experimentele următoare, a fost utilizat acest set de parametri (1 MPa amplitudine de presiune, 100 Hz frecvență impuls, 4 ms durată de explozie, 3 minute sonicare timp).

În plus față de sistemul de raportare β-galactozidază, gena luciferazei (CMV-luci) a fost utilizată ca reporter pentru a confirma transfecția in vitro mediată cu ultrasunete orientată independent. După administrarea genei luciferazei la celulele tumorale de prostată în aceleași condiții ca mai sus și folosind aceeași procedură de sonicare ca și cea utilizată pentru sistemul de raportare β-galactozidază (amplitudine de presiune 1 MPa, frecvență puls 100 Hz, lungime 4 ms). timp de sonicare, 10 μg ADN plasmidic), activitatea luciferazei a fost comparată între controale (numai ADN), soluții ADN sonicate și soluții de control transfectate cu fosfat de calciu (ADN și fosfat de calciu, fără sonicare). Activitatea luciferazei a fost de 310 ori mai mare după sonicare decât la martorii non-sonicați (Figura 4). Activitatea luciferazei indusă de metoda standard de transfecție a fosfatului de calciu a fost de doar opt ori mai mare decât activitatea luciferazei indusă de ultrasunete.

Activitatea luciferazei după ultrasunete vizate și CaPo4. Activitatea relativă a luciferazei a celulelor R3327-AT1 la 24 de ore după transfecția mediată cu ultrasunete (SUA) direcționată la locul cu gena CMV luciferază plasmidă raportatoare normalizată până la un control nesolicitat. Flacoanele au fost supuse ultrasunetelor focalizate într-un rezervor de apă timp de 3 minute la temperatura camerei (frecvența impulsului 100 Hz, lungimea exploziei 4 ms, amplitudinea presiunii pozitive 1 MPa). Pentru comparație, este raportată eficiența transfecției cu CaPo4 (n = 4, medie ± se). Diferențele dintre transfecția și controlul indus de ultrasunete, precum și între transfecția CaPo4 și ultrasunete, au fost semnificative statistic (P

Transfectarea SUA a diferitelor linii celulare. Stimularea focalizată prin ultrasunete a diferitelor linii celulare normalizată la fiecare control. Fibroblastele NIH 3T3, subclasa tumorală de prostată R3327-AT1, celulele melanomului uman (Mewo) și celulele HeLa au fost amestecate cu plasmida raportor β-galactozidază și sonicate la o amplitudine de presiune pozitivă de 1 MPa la un câmp focal de 100 Hz. și durata de spargere de 4 ms timp de 3 minute (n = 5, medie ± se).

Imagine la dimensiune completă

Eficiențele corespunzătoare ale transfecției in vitro au fost de 2% (HeLa), 4% (NIH 3T3), 12% (R3327-AT1) și 3% (Mewo) cu viabilitate celulară variind de la 50% (Mewo) la 80%. % (R3327-AT1). Prin urmare, în centrul câmpului sonor, eficiența transfecției ar putea fi indicată prin ultrasunete indusă.

Transfecție in vivo în tumoare Dunning R3327-AT1

Rezultatele analizei histologice ale experimentelor de transfecție a tumorii Dunning in vivo sunt prezentate în figurile 6 și 7. Toate cele șapte tumori de prostată R3327-AT1, care au fost injectate direct cu ADN și sonicate, au dezvăluit celule β-galactozidază într-o colorare pozitivă, albastră. În schimb, majoritatea (cinci din șapte) tumori cu injecție intratumorală de ADN fără sonicare nu au prezentat celule albastre și doar două tumori cu injecție intratumorală de ADN, dar fără sonicare au prezentat mai multe celule albastre. Această diferență în frecvența de detectare a celulelor albastre între tumorile sonicate și non-sonice a fost semnificativă statistic (P = 0,02, testul exact al lui Fisher). Comparând numărul de celule pozitive în secțiuni cu celule pozitive, am constatat că ultrasunetele au indus o creștere de 10 ori a numărului mediu de celule pozitive β-galactozidază după injecția intratumorală de ADN plasmidic comparativ cu injectarea ADN singură (P

Transfecția in vivo a tumorii de prostată R3327-AT1. Tumora de prostată R3327-AT1. Colorarea citochimică a activității β-galactozidazei după injectarea directă intratumorală in vivo a unei plasmide raportoare a β-galactozidazei (10 μg ADN). Tumorile au fost resecate la 24 de ore după sonicare, fixate în formalină tamponată și încorporate în parafină. Secțiunile de țesut (4-6 μm) au fost colorate cu tampon X-gal și contracolorate cu roșu neutru (× 160). Rezultate similare au fost obținute pentru toate cele șapte tumori injectate cu ADN și sonicate. Tumorile fără injecție ADN și tumorile cu injecție intravenoasă de ADN nu au dezvăluit celule colorate în albastru.

Imagine la dimensiune completă

Transfecție indusă de ultrasunete în tumoră de prostată R3327-AT1 in vivo. Numărul relativ de celule tumorale β-galactozidază pozitive în colorarea citochimică la animalele de control, numai după sonicare (SU), injecție intratumorală de ADN (it), injecție intratumorală de ADN plus ultrasunete (it + SUA), injecție intravenoasă (iv) și injecție intravenoasă plus ultrasunete (iv + SUA). Numărul normalizat a fost calculat prin normalizarea la tumorile ne-sonice la care s-a injectat doar soluția de ADN (adică s-au folosit coloane pentru patru până la șase tumori). Diferența în numărul de celule pozitive după injecția intratumorală de ADN cu și fără sonicare a fost semnificativă statistic (P 0, 3, test LSD). De asemenea, nu am putut demonstra prin ELISA că ultrasunetele focalizate conduc la un nivel semnificativ de exprimare a proteinelor reporter în tumori după administrarea iv de ADN plasmidic (P> 0, 2, test LSD).

Transfecție mediată cu ultrasunete in vivo

Aceleași echipamente cu ultrasunete și rezervorul de apă descrise mai sus au fost utilizate pentru experimentele in vivo. În timpul sonicării, animalele anesteziate au fost reținute într-un tub de plastic poliacrilic care a fost poziționat în rezervorul de apă prin același sistem de poziționare utilizat pentru flacoane. Temperatura apei a fost menținută la 36 ° C. Piciorul purtător de tumori a fost proiectat în apă printr-o gaură în jigul poliacrilic și fixat de un fir. Pentru sonicare, centrul tumorii a fost poziționat în focarul geometric al câmpului sonor (Figura 1) astfel încât axa centrală a propagării ultrasunetelor să nu interfereze nici cu părțile corpului animalului, nici cu tubul de plastic de la intrare sau ieșire locul tumorii. Tumorile de control au fost poziționate în baia de apă în același mod fără a fi sonicate.

Tumorile au fost injectate cu 10 μg de ADN CMV-LacZ în 50 μl PBS cu 3 minute înainte de sonicare. Injecția a fost efectuată în centrul tumorii și acul a fost mișcat încet în timpul injecției pentru a asigura o distribuție largă și pentru a evita sângerările intratumorale sau modificările mecanice ale tumorii. Pentru a evita scurgerea soluției de ADN prin canulare datorită turgorului tumorii, am testat în teste preliminare cel mai bun mod de a efectua injecția intratumorală. Am constatat că, dacă acul rămâne nemișcat timp de 2 până la 3 minute înainte de a îndepărta acul, soluția rămâne în tumoare. Pentru aplicare intravenoasă, 100 μg de ADN CMV-LacZ în 500 μl PBS au fost injectați în vena cozii animalului cu 3 minute înainte de sonicare.

Pentru analiza citochimică, tumorile au fost rezecate la 24 de ore după sonicare, fixate în formalină tamponată și încorporate în parafină. Feliile de țesut (4-6 μm) au fost colorate cu tampon X-gal și contracolorate cu roșu neutru. Stimularea a fost evaluată prin numărarea celulelor albastre pe feliile histologice folosind o grilă. Au fost comparate zone reprezentative corespunzătoare de 5 mm 2, unde au putut fi detectate cele mai multe celule albastre de pe felia individuală. Diferențele în numărul de celule transfectate și site-ul și geometria zonei de expresie genetică au fost detectate cu colorare citochimică.

Trei tumori suplimentare au fost sonicate, rezecate la 72 ore după tratament și colorate cu hematoxilin-eozină (HE).

Concentrația de proteină beta-galactozidază a fost cuantificată utilizând un ELISA (3 Prime-5 Prime, Boulder, CO, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Folosind același model biologic, condiții de ultrasunete și aplicații plasmidice ca și pentru histologie, a fost efectuat un alt set de experimente. Tumorile au fost recoltate la 24 de ore după sonicare și congelate în azot lichid. Pentru comparație, la aceste animale au fost analizate și pielea care acoperă tumora, precum și o bucată de mușchi al coapsei adiacente tumorii. Țesuturile au fost măcinate în pulbere și lizatele celulare au fost preparate folosind tampon de liză (10 m M Tris-Cl, pH 8, 1 m M PMFS, 1 μg/ml Aprotinin). Resturile de țesuturi au fost peletizate prin centrifugare la 14000 g și concentrația totală de proteine ​​a fost determinată utilizând testul Bradford (BioRad Laboratories, Richmond, CA, SUA). Valorile absorbantei au fost cuantificate folosind un cititor de plăci ELISA la o lungime de undă de 405 nm. Cantitatea de proteină β-galactozidază a fost determinată ca ng β-galactozidază per miligram de proteină. Toate probele de țesut au fost măsurate în trei exemplare.

analize statistice

Testul exact al lui Fisher a fost folosit pentru a analiza proporțiile, iar testul t al Studentului a fost folosit pentru a compara mediile. Pentru comparații multiple a fost utilizată analiza varianței (ANOVA) cu metoda diferenței cele mai puțin semnificative (LSD) a lui Fisher. În general, dimensiunea probei in vitro a fost de patru până la cinci probe pentru fiecare afecțiune și dimensiunea probei in vivo a fost de patru până la șapte tumori per afecțiune. Toate analizele au fost efectuate cu programul software Statistica 5.0, 43 și toate testele au fost cu două cozi.

Mulțumiri

Dorim să mulțumim lui Juergen Jenne pentru sprijin în măsurători cu ultrasunete fizice, Peter Peschke pentru furnizarea celulelor AT1 și sprijin în analiza histologică, Klaus Weber pentru furnizarea celulelor Mewo și Juergen Debus pentru sprijinirea studiilor. Mulțumim Alexandrei Tietze pentru asistență tehnică excelentă în experimentele pe animale. Îi mulțumim lui Thomas Wirth pentru că a discutat proiectul și a furnizat structuri de reporteri și celulele NIH 3T3 și HeLa. Această lucrare a fost susținută parțial de Deutsche Forschungsgemeinschaft (Hu 798/1-1).