laptele

  • obiecte
  • abstract
  • scopul:
  • Design de studiu:
  • Rezultatul:
  • concluzie:
  • introducere
  • metode
  • Studiul populației
  • pregătirea unei mostre
  • Colectarea datelor clinice
  • serologie
  • Analiza PCR cantitativă în timp real
  • Amplificare UL144 gene și secvențierea ADN-ului
  • Analize statistice
  • Rezultatul
  • discuţie

obiecte

  • pediatrie
  • Infectie virala
  • Transmiterea virală

abstract

Am evaluat prospectiv rata de transmitere a citomegalovirusului postnatal (CMV) prin laptele matern la sugari extrem de prematuri pentru a aborda efectul infecției cu CMV asupra sugarilor prematuri în timpul alăptării.

Design de studiu:

Au fost incluse în studiu un total de 25 de mame și 27 de copii (două seturi de gemeni) cu o greutate la naștere de 1. Infecția congenitală cu CMV este asociată cu consecințe semnificative pe termen lung, cum ar fi pierderea senzitivă a auzului și retardul mental. 2, 3 Spre deosebire de infecțiile congenitale, se pune mai puțin accent pe efectele obținerii CMV postnatale, probabil pentru că este adesea asimptomatică și se crede că duce la morbiditate scăzută. Cu toate acestea, studii recente care arată că infecțiile cu CMV postnatale la sugarii prematuri provoacă semne clinice grave, inclusiv compromisuri respiratorii, neutropenie, trombocitopenie, hepatomegalie și sindroame septice, au ridicat din nou interesul asupra efectelor acestui agent patogen în perioada imediat postnatală. 5, 6, 7

metode

Studiul populației

Acest studiu prospectiv a inclus sugarii prematuri alăptați la mamă și mamele acestora admise la Spitalul Universitar Nagoya, Spitalul Nagoya Prima Cruce Roșie și Spitalul Municipal Ogaki în perioada 1 aprilie 2003 - 30 septembrie 2004. Studiul a inclus sugari prematuri cu o vârstă gestațională de 2500 g. Comitetul de etică al fiecărei instituții a aprobat studiul și toți părinții sau tutorii au primit consimțământul informat în scris înainte de înscriere.

pregătirea unei mostre

Probele de sânge au fost prelevate de la fiecare mamă pentru testarea anticorpilor CMV în prima săptămână după naștere; colostrul a fost îndepărtat; iar probele de lapte matern au fost prelevate la fiecare 2 săptămâni până la eliberarea sugarilor. Probele de sânge și urină au fost prelevate de la fiecare sugar timp de 1 săptămână după naștere pentru a examina infecțiile congenitale cu CMV; probele de sânge și urină au fost apoi prelevate la fiecare 2 săptămâni până la externare; în momentul descărcării, a fost prelevată o altă probă de sânge pentru testarea anticorpilor CMV. Când laptele donator a fost donat copiilor, probele de lapte donator au fost prelevate la fiecare 2 săptămâni pentru screening. În cazurile în care sugarii au primit transfuzii de sânge, o parte din produsul din sânge a fost colectată pentru testare. Toate produsele sanguine transfuzate au fost pline de leuco cu filtre. Colostrul, laptele matern, laptele donator, produsele din sânge pentru transfuzie, probele de ser și urină au fost depozitate la -20 ° C înainte de utilizare.

Colectarea datelor clinice

Constatările clinice, cum ar fi intoleranța alimentară, distensia abdominală, hepatomegalie, petechii, apnee și hipotensiune, au fost evaluate și înregistrate de către medicul curant corespunzător. Probele de sânge au fost prelevate de la sugari în fiecare săptămână pentru a depista anomalii de laborator, cum ar fi neutropenia, trombocitopenia, creșterea enzimelor hepatice și hiperbilirubinemia. Medicii prezenți au fost orbiți de rezultatele testelor PCR în laptele matern și de starea serologică CMV maternă.

serologie

Anticorpii anti-CMV imunoglobulină (Ig) G și IgM au fost identificați utilizând un set de imunoanalize enzimatice (Denka Seiken, Tokyo, Japonia).

Analiza PCR cantitativă în timp real

ADN-ul a fost extras din 200 μl de ser pentru sugari, produs din sânge și lapte matern nefracționat folosind QIAamp Blood Kit (Qiagen, Hilden, Germania) și eluat în 100 μl de apă distilată. ADN-ul a fost extras din 140 μl de probe de urină pentru sugari utilizând kitul QIAamp de ARN viral (Qiagen) și eluat în 100 μl de apă distilată.

S-a efectuat PCR în timp real pentru fiecare probă de ADN extras pentru a cuantifica numărul de copii ale ADN-ului CMV. Primerii PCR și sondele utilizate în acest test au fost concepute pentru a viza gena CMV timpurie imediată. 13 PCR în timp real au fost efectuate folosind kitul TaqMan PCR și detectorul de secvență Model 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA) așa cum este descris mai sus. 9, 14, 15 Limita de detecție a acestui test a fost de 100 de copii ml-1 .

Amplificarea genei UL144 și secvențierea ADN-ului

Când ADN CMV a fost detectat în probe de urină sau ser, s-a efectuat secvențierea genei UL144. Gena UL144 a fost amplificată prin PCR imbricată. Au fost utilizați următorii grunduri PCR: grundul exterior exterior (5'-TCGTATTACAAACCGCGGAGAGGG-3 '), grundul invers exterior (5'-ACTCAGACACGGTTCCGTAA-3'), grundul intern interior (5'-CTTCCGGTAGGCATGAA-3 ') și reversul interior -GACTTATACCGT -3 '). Produsele PCR au fost secvențiate direct folosind kitul BigDye Terminator Cycle Sequence și ABI PRISM 3100 Automated Sequencer (Applied Biosystems).

Analize statistice

Diferențele în variabilele categorice au fost analizate folosind testul χ 2; Diferențele în valorile medii au fost analizate prin testul U Mann-Whitney. Analizele statistice au fost efectuate conform intenției de tratament cu Statview 5.0 (Institutul SAS, Berkeley, CA, SUA).

Rezultatul

În perioada de studiu, 25 de mame și 27 de copii (două seturi de gemeni) au îndeplinit criteriile de intrare. Vârsta gestațională mediană a fost de 26,4 săptămâni (intervalul 23, 7 până la 32, 6 săptămâni) și greutatea medie la naștere a fost de 802 g (intervalul 512-1108 g). Timpul mediu de observare a fost de 99 de zile (interval de la 70 la 154 de zile). Au fost în total 14 copii, băieți și 13 fete. Șapte copii au fost născuți vaginal și 20 au fost născuți prin cezariană.

Figura 1 arată seroprevalența mamelor CMV în cohorta noastră și frecvența transmiterii CMV. Un total de 21 din 25 de mame (84%) au fost seropozitive pentru CMV. ADN CMV a fost detectat în laptele matern la toate mamele seropozitive. ADN CMV nu a fost detectat în laptele matern al mamelor seronegative în perioada de studiu. Figura 2 arată numărul de copii ale ADN-ului CMV din laptele matern analizat prin PCR în timp real. Un total de 7 din cele 20 de probe de colostru (35%) conțineau ADN CMV. La 2 săptămâni postpartum, numărul copiilor ADN CMV a crescut și a atins un maxim de 4 până la 6 săptămâni postpartum. Eliberarea de ADN CMV în laptele matern a continuat până la 8 săptămâni după naștere. La 10 săptămâni după naștere, ADN CMV a fost detectat într-o singură probă; Nu s-a detectat ADN CMV în laptele matern la 12 săptămâni după naștere.

Seroprevalența maternă și transmiterea citomegalovirusului (CMV). Sunt prezentate seroprevalența maternă, rata de lactație a ADN-ului CMV și rata de transmitere a CMV. Transmiterea CMV a avut loc la un singur pacient.

Imagine la dimensiune completă

Cinetica numărului de copii ale ADN-ului citomegalovirusului (CMV) în laptele matern. Sunt date numărul mediu de copii ale ADN CMV din toate probele de colostru, precum și laptele matern la 21 de mame seropozitive CMV. Numărul de copii ADN CMV a fost măsurat prin PCR în timp real. Numerele de copii ale ADN-ului de colostru sunt date la vârsta de 0 săptămâni. Numărul mediu al copiei ADN CMV este indicat prin puncte negre; barele de eroare indică intervale de încredere de 95%. Linia punctată arată limita de detecție a testului.

Imagine la dimensiune completă

În toți cei 15 din cei 27 de copii, au fost hrăniți cu lapte donator cel puțin o dată. Laptele donator a fost furnizat unui pacient de către un singur donator. PCR a fost efectuată pe un total de 23 de probe de lapte donator și ADN CMV a fost detectat în 13 din 23 de probe (57%). Ca urmare, 10 din 15 sugari (67%) au primit lapte donator CMV ADN pozitiv. Un copil a cărui mamă era seronegativă a fost hrănit cu lapte donator, dar nu a fost detectat ADN CMV în laptele donator primit de copil.

Un total de 20 din 27 de copii au necesitat o transfuzie de globule roșii. Numărul mediu de transfuzii de globule roșii a fost de 2 (interval de 1 până la 8 ori). Unul din 27 de copii a necesitat o transfuzie de trombocite. ADN CMV nu a fost detectat în niciuna dintre probele de sânge utilizate pentru transfuzii.

În populația studiată, IgM anti-CMV a fost negativ la externare la toți, cu excepția unui singur copil. Dintre cei 21 de sugari ale căror mame au testat pozitiv pentru IgG anti-CMV, 4 copii au fost pozitivi pentru CMV IgG după externare, dar 17 au fost negativi. La 4 sugari pozitivi, s-au prelevat probe de sânge pentru testarea anticorpilor CMV în medie 77 zile (interval 70 - 84 zile) postpartum, semnificativ mai devreme decât la 17 sugari negativi cu o medie de 98 zile probe de sânge. (intervalul 70-154 zile) (P = 0,02). Aceste date sugerează că patru copii pozitivi au păstrat IgG anti-CMV cu transmitere pasivă de la mame. Toți cei cinci copii ale căror mame au fost negative pentru IgG anti-CMV au avut IgG anti-CMV negativ la externare.

discuţie

Diosi și colab. Primele 17 CMV izolate din laptele matern în 1967. Studiile ulterioare au arătat că rata virolactiei din laptele fracționat variază de la 9 la 32%. 18, 19, 20 Recent, reactivarea CMV materne în timpul alăptării a fost analizată prin PCR. 9, 10, 11, 12, 21, 22, 23 În aceste studii, rata de lactație ADN CMV a variat de la 87,5 la 97,3%. În studiul nostru, toate mamele seropozitive au avut ADN CMV în laptele matern. Aceste descoperiri susțin ideea că reactivarea CMV are loc în timpul alăptării la majoritatea mamelor seropozitive. Am cuantificat numărul de copii ale ADN-ului CMV din laptele matern prin PCR în timp real și am descris cinetica longitudinală a reactivării CMV. În studiul nostru anterior, în care populația era semnificativ mai în vârstă decât în ​​acest studiu (vârsta gestațională medie, 31 vs 26 săptămâni; P 9 2 săptămâni postpartum, ADN CMV a fost detectat la niveluri crescute de lapte matern și a atins un maxim de 4 până la 6 săptămâni postpartum în acest studiu, cinetica reactivării CMV a fost aproape aceeași, sugerând că reactivarea CMV maternă este independentă de vârsta gestațională la naștere și că reactivarea CMV în timpul alăptării începe la 1 până la 2 săptămâni postpartum și se termină la 10 săptămâni postpartum.

Am detectat ADN CMV la un copil care a primit lapte CMV pozitiv. Pentru a confirma calea de transmisie, am efectuat un studiu epidemiologic molecular. Cea mai comună genă a variantei de tulpină la CMV umană este glicoproteina B. 24 Anul trecut, însă, s-a acordat o atenție considerabilă genei CMV UL144. UL144 codifică un omolog al mediatorului de intrare a virusului herpes, membru al superfamiliei receptorului factorului de necroză tumorală 1 și poate fi un marker genetic pentru patogeneza CMV umană. 25 Lurain și colab. 26 au raportat că UL144 a avut o variabilitate semnificativă a secvenței specifice tulpinii și, prin urmare, am concentrat-o pe identificarea tulpinii. Toate secvențele identificate în laptele matern al mamei s-au potrivit exact cu secvențele din probele de urină ale bebelușului lor. CMV postnatal poate fi obținut prin secretarea colului uterin în canalul de naștere, transfuzie de sânge și lapte matern. Unul dintre copiii noștri infectați s-a născut prin cezariană, dar i s-au făcut transfuzii de sânge de două ori. Toate produsele din sânge au fost umplute cu leucoform și, prin urmare, CMV a fost în mare parte eliminat; de fapt, ADN-ul CMV nu a fost detectat în niciuna dintre probele de sânge. Prin efectuarea unei caracterizări moleculare a perechii mamă-copil, am confirmat că transmiterea CMV a avut loc prin laptele matern.

Pasteurizarea poate inactiva CMV în laptele matern. 20, 32 Hamprecht și colab. 34 au raportat o reducere a infectivității CMV a laptelui matern prin trei metode: înghețarea și dezghețarea, pasteurizarea titularului și încălzirea pe termen scurt timp de 5 s la 72 ° C. Infectivitatea CMV a fost eliminată în doar 1 din 10 probe prin congelarea laptelui, dar complet eliminat prin pasteurizare Holder și încălzire pe termen scurt. Cu toate acestea, procesele de încălzire au mai multe probleme: încălzirea poate avea un efect negativ asupra calității laptelui matern, procesele necesită echipamente speciale, laptele matern consumă mult timp pentru a se prepara prin pasteurizare de către titular și posibilitatea de a elua substanțe periculoase din sticlele de plastic. încălzirea nu poate fi exclusă. Kurath și colab. 7 nu recomandă o abordare generală, nici prin evitarea sau pasteurizarea laptelui matern, care se bazează pe o rată scăzută de boli simptomatice, chiar și la sugarii prematuri cu risc ridicat. În schimb, pentru a preveni o infecție gravă, aceștia au propus un algoritm pentru sugarii de prematuri în cazul unei mame CMV IgG pozitive pe baza stării de sănătate a sugarului prematur. 36

În concluzie, conform cineticii apariției ADN-ului CMV în laptele matern, reactivarea CMV începe la 1 până la 2 săptămâni după naștere și se termină la 10 săptămâni după naștere. Chiar și la sugarii extrem de prematuri, rata de transmitere a CMV a fost scăzută și niciunul dintre copiii care transmit CMV nu a dezvoltat simptome severe în instituțiile noastre, unde a fost utilizat în principal lapte congelat. Laptele matern înghețat și dezghețat poate reduce rata infecției verticale cu CMV și a bolilor grave, deși, în cazuri rare, această metodă nu poate preveni complet simptomele severe de tip sepsis și enterocolita necrozantă. 5