Snow UNIVERSITY OF TECHNOLOGY BRN UNIVERSITY F TECHNLGY Facultatea de chimie Departamentul de chimie PTRAVIN A BITECHNLGIÍ FACULTY F CHEMISTRY INSTITUTE F FD SCIENCE AND BITECHNLGY IZLACE BSAHVÝCH S CANNABIS SATIVA ȘI ANTIFLGISTF TEZĂ AUTR PRÁCE Bc. ZUZANA BARANVÁ AUTHR SUPERVISOR PharmDr. Daniela VESELÁ SUPERVISR BRN 2015

brno

Universitatea de Tehnologie Brno Facultatea de Chimie Purkyňova 464/118, 61200 Brno 12 Formular de atribuire a lucrării de masterat Numărul lucrării de masterat: FCH-DIP0892/2014 An universitar: 2014/2015 Departamentul: Departamentul de chimie a alimentelor și biotehnologie Student: Bc. Zuzana Baranová Programul de licență: Chimia și tehnologia alimentelor (N2901) Domeniul de studiu: Chimia și biotehnologia alimentelor (2901T010) Conducător de teză PharmDr.Daniela Veselá Consultanți: doc. Ing. Jirina Melkova, CSc. Titlul tezei de diplomă: Izolarea constituenților Cannabis sativa și efectul lor antiflogistic Atribuirea tezei de diplomă: 1. Realizați o revizuire literară a problemei 2. Descrieți metodele de evaluare utilizate 3. Procesați rezultatele măsurate din experimente 4. Evaluați rezultatele obținute în forma unei discuții Data limită de depunere a tezei de diplomă: 11.5.2015 Teza de diplomă se depune la numărul stabilit de decan la secretariatul departamentului și în formă electronică conducătorului tezei. Această atribuire este o anexă la teza de diplomă. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Bc. Zuzana Baranová PharmDr.Daniela Veselá prof. RNDr. Ivana Marova, CSc. Director de teză de student Director al Institutului din Brno, la 30.1.2015 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - prof. Ing. Dr. Martin Weiter Decanul Facultății

BARANVÁ, Z. Izolarea constituenților Cannabis sativa și efectul lor antiflogistic. Brno: Universitatea de Tehnologie Brno, Facultatea de Chimie, 2015. 73 p. Director teză PharmDr. Daniela Veselá. DECLARAȚIE Declar că am pregătit teza de diplomă în mod independent și că am citat corect și complet toate sursele literare utilizate. Teza de diplomă este proprietatea Facultății de Chimie, BUT din Brno și poate fi utilizată în scopuri comerciale numai cu acordul conducătorului tezei și al decanului FCH BUT. semnătura studentului Mulțumiri: aș dori să mulțumesc PharmDr. Daniel Veselej pentru timpul pe care mi l-a dedicat și sfaturile care m-au emoționat în elaborarea tezei de diplomă. Mulțumirile mele merg și către RNDr. Dr. Jan Hošek, care m-a însoțit în măsurarea activității antiinflamatorii și m-a familiarizat cu problema. 4

4.1.6 Separarea fracțiilor. 47 4.2 Identificare. 52 4.2.1 Analiza spectrelor UV. 52 4.2.2 Analiza spectrului IR. 53 4.2.3 Identificarea prin RMN. 54 4.2.4 Rezultatele identificării substanțelor izolate. 55 4.3 Pregătirea celulelor THP1. 56 4.3.1 Metode. 56 5 Concluzie. 60 6 Literatura citată. 63 7 Lista abrevierilor. 71 6

Flavon apigenin luteolin 5,7,4'-H 5,7,3 ', 4'-H Flavonol kaempferol morin quercetin rutin 3,5,7,4'-H 3,7,2', 4 ', 5'- H 3,5,7,3 ', 4'-H 5,7,3', 4'-H; 3- R2 Flavanonă (dihidroflavonă) hesperidină naringenină taxifolină 5,7,3 ', 4'-H 5,7,4'-H 3,5,7,3', 4'-H Isoflavonă genistină 5,4'-H; 7- R3 Antocianină apigenidină cianidină 5,7,4'-H 3,5,7,4'-H; 3,5-CH3 * Chalcona trihidroxiciclona 2,4,2'-H R1: galat; R2: ramnoglucoză; R3: glucoza * Calconii sunt precursori ai flavonoidelor, dar unii autori le clasifică în diviziunea generală a flavonoidelor în grupuri [10]. 2.4.1 Principalele subgrupuri de flavonoide 2.4.1.1 Calconii Calconii sunt precursori ai flavonoidelor. Acestea se caracterizează prin absența unui inel C în structura de bază a scheletului flavonoid. Prin urmare, acestea sunt denumite și flavonoide cu lanț deschis. Calconii includ, de exemplu, floridzina, floretina și chalconarenina. Se găsesc în cantități semnificative în roșii, pere, căpșuni și anumite produse din fibre. Calconii și derivații lor merită atenție datorită numeroaselor beneficii nutriționale și biologice [11,12]. Figura de sub paragraf (a se vedea Figura 2) prezintă structura de bază din care sunt derivate toate calconiile. Chalkón brázok č. 2: Structura de bază a chalkonului 11

H H H H Quercetin H 2.8.1.9 Vitexin brázok č. 16: Structura quercetinei Vitexin (vezi Figura 17) clasificată ca flavonoid C-glucozid. Metabolizarea in vivo a vitexinului a fost evaluată la șobolani. Vitexina induce apoptoza și suprimă creșterea celulelor tumorale, are un efect antioxidant potențial și poate fi utilizată eficient pentru a preveni reacțiile adverse ale pielii induse de radiațiile UV, cum ar fi producția de radicali liberi și deteriorarea celulelor pielii [54,55]. Vitexina are un efect hipotensiv potențial datorat blocării ganglionare. Are un efect protector semnificativ împotriva leziunilor miocardice. Efectul antiinflamator a fost indicat pe baza proprietăților sale antihistaminice, antibradikininice și antiserotoninice. Alte utilizări clinice includ activități antivirale, antitiroidiene, antisclerotice și antihepatotoxice. Capacitatea vitexinului de a inhiba radicalii superoxizi duce la aplicarea potențială a efectului său anti-îmbătrânire în industria cosmetică [54,55]. Vitexina împreună cu izovitexina administrate pe cale orală reduc semnificativ glicemia postprandială. stimulează secreția de insulină și inhibă α-glucozidaza, ajutând astfel pacienții care suferă de diabet [54,55]. H H H H H H H Hite Vitexin nr. 17: Structura vitexinului 29

Prin agitare în diferiți solvenți, am împărțit substanțele în 4 porții. Porțiunile au fost evaporate pe un evaporator sau liofilizate în cazul apei și substanța uscată obținută a fost cântărită. 3.2.1.2 Produse chimice Gradul de gradient acetonitrilic (Scharlau) Benzen p.a. (Penta) Cloroform p.a. (Penta) Acetat de etil p.a. (Penta) Acid acetic p.a. (Penta) Metanol p.a. (Penta) Gradient de metanol (Scharlau) Apă pentru HPLC preparată folosind aparatul de mai jos Amestec reciclat compus din aproximativ 10% apă, 10% metanol și 80% acetonitril 3.2.1.3 Material pentru TLC HPLC cromatografie coloană LC folie de aluminiu Silikagel 60, F254 20 cm 20 cm, grosimea stratului 0,2 mm (Merck) coloană analitică: Acentis Express C8, 15 cm 2,1 mm, dimensiunea particulelor 2,7 μm coloană pregătitoare: Supelcosil TM LC-8 SEMI-PREP, 25 cm 10 mm, dimensiunea particulelor 5 µm ambalare coloană: Gel de siliciu Sigma-Aldrich 60 Å, dimensiunea particulelor 0,04 0,63 mm 3.2.1.4 Aparat Evaporator rotativ sub vid Liofilizator BŰCHI Baie de apă B-480, Rotavapor R-114 (Büchi, Elveția) BŰCHI Pompa de vid V- 700, Regulator de vid V-850, Rotavapor R-3 (Bűchi, Elveția) CHRIST Alfa 1 2 LD (Hristos, Germania) 31

Cromatografie pe coloană Faza staționară: Faza mobilă: silicagel cu mărimea granulelor de 0,040 0,063 mm cloroform, benzen, metanol într-un raport de 7: 2: 1 (v/v/v) Procedură: Fracțiile din fracția de cloroform au fost colectate în aproximativ Fracții de 100.150 ml, fracții din hexan în aproximativ 40 până la 50 ml, apoi analizate prin TLC și HPLC. Pe baza similarității compoziției, acestea au fost combinate și apoi evaporate pe un evaporator sub vid. Cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) Instrument analitic: Agilent 1100, detector UV DAD Faza staționară: Acentis Express C8, 15 cm 2,1 mm, dimensiunea particulelor 2,7 μm Eluare: gradient Fază mobilă: Metodă 1: 0. minut: 50% MeCN, 50 % HCH (0,2%) minutul 24: 83% MeCN, 17% HCH (0,2%) 24,1. minut: 100% MeCN Debit: 0,3 ml/min volum de injecție: 1 μl Temperatura coloanei: 40 C Detecție: UV la lungimi de undă λ 254 și 280 nm Semipreparativ cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) Instrument: YL9100 Sistem HPLC Fază staționară: Acentis Express C8, 25 cm 10 mm, dimensiunea particulelor 5 µm Eluare: gradient Faza mobilă: Metoda 2: 0. minut: 90% reciclat, 10% HCH (0,2%) 15 minute: 95% reciclat, 5% HCH (0,2%) 15.01. minut: 100% ACN 25.01. minut: 100% MeH 40.01. minut: 90% reciclat, 10% HCH (0,2%) Debit: 5 ml/min volum de injecție: 25 μl Temperatura coloanei: 40 C Detecție: UV la lungimile de undă λ 254 și 280 nm 33

3.2.2.2 Identificare Spectrofotometrie UV Spectrele UV ale substanțelor izolate au fost măsurate folosind un instrument Agilent DAD UV/VIS împreună cu analiza HPLC. Aceste spectre au fost utilizate pentru a estima structura compușilor. Rezultatele au fost comparate cu spectrele UV bazate în baza de date școlară a VFU din Brno. Spectrofotometria IR Spectrele IR au fost măsurate folosind un instrument Nicolet Impact 400D FT-IR ca o funcție a transmitanței ca lungime de undă a radiației. Probele au fost măsurate în formă solidă prin metoda ATR. Corecția ATR, corecția pentru H2 și C2 și netezirea automată a spectrului au fost aplicate pentru a măsura spectrul. Prin evaluarea spectrelor, s-au obținut informații despre prezența diferitelor grupuri funcționale în structura probei analizate. Analiza rezonanței magnetice nucleare prin rezonanță magnetică nucleară a fost efectuată în străinătate la Universitatea din Mississippi. 34