periferice

  • obiecte
  • abstract
  • Principalul
  • Materiale și metode
  • Protocol
  • Evaluarea și urmărirea cazului
  • imunohistochimie
  • Pregătirea pieselor înghețate
  • Rezultatul
  • Semne clinice
  • Imunohistochimie periferică
  • Un grup de pacienți
  • Secțiuni înghețate
  • discuţie

obiecte

  • Boli coloniale
  • diagnostic
  • imunohistochimie

abstract

Principalul

Aganglionoză congenitală a intestinului sau boala Hirschsprung este rezultatul malformației sistemului nervos enteral. Motilitatea adecvată a tractului gastro-intestinal necesită inervație de către un sistem nervos enteric dezvoltat corespunzător și matur. Absența celulelor ganglionare interne din rectul distal și lungimea variabilă a intestinului adiacent este o caracteristică de diagnostic dezirabilă a bolii Hirschsprung. În dezvoltarea embriologică, fibrele nervoase intestinale migrează caudal cu fibrele vagale și ajung în colon în decurs de 12 săptămâni. În urmă cu zece ani, pierderea mutațiilor funcționale în mai multe gene, inclusiv buza proto-oncogenei, sa dovedit a fi implicată în dezvoltarea aganglionozei. 1 Aceste mutații de „pierdere a funcției” sunt cunoscute nu numai că afectează dezvoltarea și migrația celulelor ganglionare, ci sunt implicate și în moartea timpurie a celulelor ganglionare. 2

Examinarea biopsiilor rectale pentru prezența sau absența celulelor ganglionare se efectuează la pacienții suspectați de boala Hirschsprung. În unele cazuri, identificarea celulelor ganglionare poate fi dificilă, în special la populația cu cel mai mare risc de a dezvolta un nou-născut cu boala Hirschsprung. La acești pacienți, celulele ganglionare imature pot fi confundate cu celulele endoteliale, alte celule mezenchimale și celule inflamatorii. Din acest motiv, multe instituții folosesc colorarea histochimică cu acetilcolinesteraza pe țesutul rectal înghețat ca adjuvant la diagnosticul de aganglionoză. Cu toate acestea, diagnosticarea precisă a acestor pete de felii înghețate necesită un nivel ridicat de expertiză, în special în cazuri neclare. 3, 4 Alternativ, identificarea hipertrofiei neuronale poate fi o modalitate de diagnostic adjuvant utilă în cazul aganglionozei. Se raportează că 90% din biopsiile rectale la pacienții cu boala Hirschsprung au tulpini nervoase submucoase de aproximativ 40 μm în diametru. 5

Ca urmare a acestor probleme de diagnostic, s-au dezvoltat o serie de pete imunohistochimice care ajută la identificarea celulelor ganglionare. Anticorpi împotriva enologiei neuron-specifice (NSE), 6, 7, periferice, 7, 8, 9, 10 catepsina D, 8, 11 bcl-2, 12 NeuN, 13 receptor de proteine ​​morfogenetice osoase IA (BMPRIA), 14 neurofilament, 7, 15 tubulină, 15 oncoproteine ​​de buze, 16 și mai recent MAP-2 17 au avut toate succes în evidențierea celulelor ganglionare, care sunt dificil de identificat cu colorarea hematoxilinei și eozinei (H&E).

În 2002, am dezvoltat și implementat un protocol folosind colorarea imunohistochimică periferică combinată cu evaluarea H&E pentru a identifica celulele ganglionare în biopsiile rectale. După studierea literaturii, am ales periferice pentru a spori celulele ganglionare, deoarece acestea au arătat o colorare puternică a celulelor ganglionare în țesuturile intestinale adulte și pediatrice. Am observat că a existat o ușoară imunocolorare a fibrelor nervoase granulare; cu toate acestea, nu a fost niciodată dificil să distingem această colorare de colorarea citoplasmatică densă tipică a grupurilor de celule individuale și ganglionare. De asemenea, am efectuat colorarea imunohistochimică a S-100 ca supliment pentru a identifica hipertrofia neuronală. Iată rezultatele protocolului nostru din ultimii 7 ani.

Materiale și metode

Protocol

Protocolul constă din opt niveluri de H&E, doi anticorpi periferici și două imunoanalize S-100. Diapozitivele colorate pentru imunocolorare au fost obținute la nivelurile 3, 4 și 8, 9 din bloc. Cu excepția cazului în care celulele ganglionare au fost identificate prin protocolul original, s-au efectuat colorare H&E suplimentară și colorare periferică.

Pe o perioadă de șapte ani, 10 patologi din instituția noastră au interpretat aceste biopsii rectale. Dacă nu existau celule ganglionare în protocolul inițial, existau diferențe între patologii diagnosticați în ceea ce privește numărul de niveluri suplimentare de H&E și imunostainele care ar aranja. Numărul de H&E comandate a variat de la încă 10 niveluri la secțiuni seriale prin bloc.

Evaluarea și urmărirea cazului

După aprobarea de către Institutional Review Board, toate biopsiile obținute pentru a exclude boala Hirschsprung au fost obținute din arhivele patologice ale Facultății de Medicină din Georgia din 2002 până în 2009. Toate cazurile au fost diagnosticate folosind un protocol pentru colorarea imunohistochimică a perininei și S-100 . Fiecare caz a fost evaluat pentru prezența sau absența celulelor ganglionare și a hipertrofiei nervoase. Dacă celulele ganglionare erau prezente, am determinat dacă au fost detectate la protocolul inițial sau la niveluri repetate. Dacă celulele ganglionare lipseau, am evaluat probele de rezecție pentru prezența sau absența segmentului agangli. Urmărirea disponibilă a fost obținută utilizând analize grafice ale pacienților. În plus, a fost efectuată o revizuire pentru a evalua pacienții care au suferit secțiuni înghețate.

imunohistochimie

Imunohistochimia a fost efectuată după deparafinizarea cu xilen a secțiunilor de replicare și folosind metoda standard avidină-complex biotină. Au fost utilizați anticorpi împotriva următoarelor antigene: periferic (PJM50 monoclonal; 1: 100; Vector Laboratories, Burlingame, CA, SUA) și S-100 (policlonal; 1: 6000; Dako Corporation, Carpenteria, CA, SUA). Colectarea de antigeni pentru imunohistochimia periferică a implicat căldura aragazului sub presiune cu o citire țintă de pH 6, 0. Nu s-a utilizat niciun pretratament pentru imunohistochimia S-100.

Colorarea imunologică a periferiei a fost considerată pozitivă dacă colorarea citoplasmatică caracteristică a celulelor ganglionare a fost identificată în plexul nervos (Figurile 1a și b). Diametrul maxim al fibrelor nervoase submucoase a fost evaluat prin imunocolorare cu S-100 prin micrometrie vizuală. În cazurile cu ganglion pozitiv, s-a avut grijă să nu se măsoare expansiunea bulbică a fibrelor nervoase în timp ce acestea curg prin ganglioni (Figura 1d).

A ) Imunocolorarea tipică a grupurilor de celule ganglionare periferice (× 40). b ) Colorarea periferică a celulelor ganglionare cu depuneri granulare în fasciculul nervos (săgeată) la intrarea în ganglion (x 100). c ) imunocolorare liniară și granulară slabă a micilor fascicule nervoase din submucoasă (săgeți) (× 40). ( d ) Colorare negativă a celulelor ganglionare la un pacient fără un pacient Hirschsprung cu imunocolorare S-100 (x 100).

Imagine la dimensiune completă

Pregătirea pieselor înghețate

Țesuturile primite pentru secțiuni înghețate au fost tăiate în secțiuni de 5 μm conform unui protocol standard. O lamelă a fost fixată în etanol 95% și colorată cu H&E. A doua lamă a fost lăsată să se usuce la aer și colorată cu un protocol standard Diff Quick.

Rezultatul

Semne clinice

Au fost selectate pentru evaluare 138 de cazuri consecutive. Două cazuri nu au fost diagnosticate din cauza absenței țesutului submucos și nu s-au efectuat biopsii repetate. În celelalte cazuri, erau 90 de bărbați și 46 de femei. O sută nouă pacienți aveau celule ganglionare, dintre care 66 erau bărbați și 43 femei. Dintre cei 27 de pacienți fără celule ganglionare, 23 erau bărbați și 4 erau femei, corespunzând unei predominanțe masculine a bolii Hirschsprung.

Pacienții au variat între 2 zile și 55 de ani. Patruzeci și unu (41%) de pacienți cu celule ganglionare prezente la vârsta de 1, 2, 3 ani și la cererea chirurgilor au prezentat biopsii repetate ale celulelor ganglionare. Un pacient cu perforație cecală și celule ganglionare a fost identificat în apendice și apendice. Biopsia rectală ulterioară a fost pozitivă pentru celulele ganglionare. Un pacient a suferit o rezecție a colonului distal atrial cu confirmarea celulelor ganglionare din segmentul rezecat. Biopsia rectală ulterioară a fost pozitivă pentru celulele ganglionare.

Colorarea imunohistochimică a S-100 ar putea fi evaluată la 107 pacienți cu celule ganglionare (diametru mediu 20 μm (interval 8-55 μm)). 103 dintre ei au ascuns mănunchiuri de nervi

A ) Colorarea imunologică a S-100 subliniază hipertrofia neuronală la un pacient cu boala Hirschsprung (× 40). ( b ) Creșterea fibrilelor nervoase ale mucoasei și lamelei musculare cauzate de un pacient cu boala Hirschsprung la colorarea S-100 (× 100). c ) Colorarea Quik difuză dezvăluie citoplasma celulelor ganglionare albastre strălucitoare (x 40). d ) inspecția secțiunii înghețate utilizând H&E (× 20).

Imagine la dimensiune completă

Secțiuni înghețate

Au fost efectuate analize ale secțiunilor înghețate la 26 de pacienți. Dintre acești 26, 22 de pacienți au avut rezecții pentru boala Hirschsprung, doi au avut biopsii repetate (confirmarea intraoperatorie a prezenței celulelor ganglionare) și doi au avut biopsii de novo. Protocolul Diff Quick a colorat citoplasma celulelor ganglionare albastre strălucitoare, accelerând evaluarea intraoperatorie (Figurile 2c și d). Un total de 57 de secțiuni înghețate au fost efectuate la acești pacienți, 95% (54 din 57) fiind de acord cu secțiunile permanente. S-a constatat că cele trei valori aberante sunt erori de eșantionare.

discuţie

Din punct de vedere istoric, evaluarea tulpinilor nervoase submucoase și a tulpinilor nervoase muscularis și lamina propria au fost cruciale în confirmarea pacienților cu suspiciuni de aganglionoză. Colorarea histochimică cu acetilcolinesteraza este utilizată pe scară largă ca adjuvant la identificarea și tiparea nervilor parasimpatici în biopsiile rectale. Procesul care necesită obținerea țesutului înghețat este potențial toxic și, de asemenea, consumă mult timp. În plus, petele pot fi dificil de interpretat, mai ales în cazuri neclare. 3, 4 Cerințele pentru interpretarea acestei colorări sunt bine documentate cu rezultate pozitive false, 4, 5, 6, 8, 9, 18, 19, 20, 21, 22 și neclar 19, 22.

Am constatat că utilizarea colorării Diff Quik pe țesutul înghețat subliniază celulele ganglionare prin colorarea citoplasmei lor cu o culoare albastră strălucitoare. Colorarea este ușor disponibilă, ieftină și netoxică și poate fi aplicată direct pe secțiuni de țesut înghețat. În plus, nu necesită cunoștințe tehnice. Contrastul dintre colorarea albastru strălucitor din celulele ganglionare și colorarea violet pal în restul țesuturilor facilitează identificarea rapidă și ușoară a celulelor ganglionare în mediul intraoperator. Atunci când sunt utilizate împreună cu lamele colorate H și E, petele Diff Quik acționează ca un complement, scurtând timpii de interpretare a secțiunilor înghețate.

În concluzie, o examinare amănunțită a mai multor secțiuni ale H&E asociate cu coloranții imunohistochimici adjuvanți periferalin și S-100 s-au dovedit a fi o modalitate foarte sensibilă și specifică pentru identificarea celulelor ganglionare în biopsiile rectale de aspirație. În timpul studiului, această precizie diagnostică a fost menținută la mai mulți patologi nematogastinali și non-pediatrici. Acest protocol a îmbunătățit eficiența laboratorului, deoarece secțiunile seriale H&E au fost necesare în mai puțin de 30% din cazuri. În plus, recuperarea de rutină a țesutului înghețat nu a fost necesară. Toate acestea au fost realizate, menținând un timp de răspuns de 24 de ore în 93% din cazuri.