pacient

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Materiale și metode
  • Secvențierea clinică a exomului
  • Cultura celulară și transfecție
  • Extracția ARN și sinteza ADNc
  • Dezintegrarea mediată de prostii
  • RT-PCR cantitativ
  • Construcții de expresie ADN și mutageneză direcționată către situs
  • SDS-PAGE și western blot
  • Microscopie fluorescentă
  • Testele reporterului Luciferase
  • Transfer de energie rezonantă bioluminiscentă (BRET)
  • Semnificație statistică
  • Rezultatul
  • Fenotip clinic
  • Nou o variantă variantă a FOXP1 identificată prin secvențierea exoma
  • Caracterizarea funcțională a unei variante de secvență FOXP1 în celulele umane
  • discuţie
  • trepte
  • GenBank/EMBL/DDBJ
  • Informatii suplimentare
  • Documente Word
  • Informatii suplimentare
  • Fișiere imagine
  • Figura suplimentară 1
  • Figura 2 suplimentară

obiecte

  • Genomică funcțională
  • Genetica sistemului nervos
  • Tulburări ale dezvoltării neurologice
  • Secvențierea noii generații

abstract

FOXP1 (proteina P1 a cutiei anterioare) este un factor de transcripție care este implicat în dezvoltarea mai multor țesuturi, inclusiv a creierului. Fenotipul emergent al pacienților cu variante FOXP1 care perturbă proteinele include întârziere globală de dezvoltare, dizabilitate mintală și deficite de vorbire/limbaj ușoare până la severe. Vorbim despre un copil cu antecedente de hipotensiune arterială severă, tulburare a spectrului autist și dizabilitate mentală ușoară, cu tulburări severe de vorbire/limbaj. Secvențierea clinică a exomului a identificat o variantă de novo heterozigotă a FOXP1 c.1267_1268delGT (p.V423Hfs * 37). Analizele funcționale utilizând modele de celule indică faptul că varianta perturbă mai multe aspecte ale activității FOXP1, inclusiv localizarea subcelulară și proprietățile represive transcripționale. Descoperirile noastre indică importanța efectuării caracterizării funcționale pentru a ajuta la dezvăluirea semnificației biologice a variantelor identificate prin abordări genomice, oferind astfel o perspectivă asupra căilor care stau la baza tulburărilor neurodezvoltatoare complexe. În plus, datele noastre susțin ipoteza că variantele de novo reprezintă factori cauzali semnificativi în tulburările sporadice severe și extind fenotipul observat la indivizii cu haploinsuficiență FOXP1.

FOXP1 (proteina furculiței P1; OMIM 605515) aparține familiei de gene proteice a factorului de transcripție FOX, definită prin prezența unui domeniu caracteristic de legare a ADN-ului cunoscut sub numele de cutie cu furcă (FOX). 1 Orthologul șoarecelui, Foxp1, este necesar pentru dezvoltarea normală a inimii, plămânilor și esofagului 2, 3 și acționează ca un adjuvant al factorilor de transcripție Hox în reglarea proiecției și atașării neuronilor motori la mușchii țintă. 4, 5 Importanța Foxp1 în dezvoltarea neuronală este evidențiată de studiile efectuate la șoareci cu o ștergere specifică a creierului Foxp1. 6 Acești șoareci mutanți prezintă afectarea dezvoltării neuronale și comportamentul autist. În ultimii ani, variantele FOXP1 au fost raportate la mulți pacienți cu tulburări de spectru de autism sporadic (ASD), dizabilitate mintală (ID), întârziere globală a dezvoltării și întârziere de vorbire moderată până la severă, unde vorbirea expresivă este cea mai afectată (OMIM 613670)., 7, 8 Prezența tulburărilor de vorbire și limbaj ca caracteristică a sindromului de insuficiență FOXP1 este interesantă deoarece cea mai similară genă pentru FOXP1 este FOXP2, care este perturbată în forma rară a tulburărilor de vorbire și limbaj (OMIM: gena 605317, tulburare 602081 ).,

Variantele FOXP1 identificate la pacienții cu TSA și/sau ID includ ștergeri de gene întregi, 7, 9, 10, 11, 12 translocații, 13 variante fără sens, 14 variante de sens 15 și variante de schimbare cadru. 16 Identificarea delețiilor întregii gene sugerează că mecanismul patogenității este haploinsuficiența. Severitatea fenotipului sugerează că aceste mutații nu pot fi moștenite și, în toate cazurile în care ADN parental a fost testat, s-a constatat că variante apar de novo. Folosind secvențierea generației următoare, am identificat și caracterizat de novo variante de FOXP1 la o fată cu antecedente de hipotensiune arterială severă, TSA și ID ușoară cu deficiențe severe de vorbire/limbaj în acest studiu.

Materiale și metode

Secvențierea clinică a exomului

Secvențierea clinică a exomului probandului și a părinților săi neafectați a fost efectuată la Centrul de Genomică Clinică UCLA (pentru o descriere detaliată a conductei de exoma clinic UCLA, vezi Lee și colab. 17). La un pacient a fost identificată o singură variantă de codificare de novo, de calitate înaltă, care nu afectează gena FOXP1. Această variantă de secvență a avut un scor de calitate ≥ 500, fără citiri care să susțină alela alternativă la părinți și nu a fost niciodată observată la populația generală (pe baza proiectului 1k Genomes, dbSNP135, NHLBI ESP). La pacient nu s-au identificat variante ereditare clinice semnificative homozigote, hemizigote, homoplasmatice sau combinate.

Cultura celulară și transfecție

Celulele limfoblaste vii transformate cu virusul Epstein-Barr au fost obținute de la tată, mamă, proband și un frate neafectat. Culturile au fost cultivate în RPMI-1640 (Lonza, Verviers, Belgia) suplimentat cu 10% ser fetal bovin (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA). Celulele HEK293 au fost crescute în DMEM și SHSY5Y în DMEM-F12 (Invitrogen). Mediul a fost suplimentat cu 10% ser fetal bovin (Invitrogen). Transfecțiile au fost efectuate folosind GeneJuice conform instrucțiunilor producătorului (Merck-Millipore, Amsterdam, Olanda).

Extracția ARN și sinteza ADNc

ARN-ul total a fost extras din limfoblastele imortalizate folosind kitul RNeasy Mini (Qiagen, Venlo, Olanda) și ADNc cu catenă primă a fost generat folosind un kit de transcripție inversă a ADNc de mare viteză (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, SUA).

Dezintegrarea mediată de prostii

Degradarea mediată prin prostii (NMD) a fost evaluată așa cum s-a descris anterior. 16 cADN-ul FOXP1 a fost amplificat prin PCR folosind primeri 5'-GTCTACAGAACCCAAAGCCGC-3 'și 5'-GGTTCTGCGCAATATCTGCTG-3' inversi, urmat de secvențierea Sanger.

RT-PCR cantitativ

RT-PCR cantitativ a fost efectuat și analizat așa cum s-a descris anterior 18 folosind primerii specifici pentru amplificarea FOXP1 c.1267_1268delGT (înainte 5'-CGTCACCCAAGGCCCCTCTC-3 '; invers 5'-TTGCGTCGGAAGTAAGCAAAC-3'), urmat de secvențierea Sanger.

Construcții de expresie ADN și mutageneză direcționată către situs

Wildtype (WT) FOXP1 și FOXP2 au fost amplificate prin PCR și donate în pCR2.1-TOPO (Invitrogen). 19 Varianta p.V423Hfs * 37 FOXP1 a fost generată folosind pCR2.1-TOPO.FOXP1 ca șablon cu kitul de mutageneză QuikChange II Site-Direct (Agilent Technologies, Wilmington, DE, SUA) și înainte 5'-TGGTGGTTGTGATGAGAGGGGGGGGG-3 ' Primeri 5'-CCCAAGGCCCCTCTCATCACAACCACCA-3 '. ADNc-urile FOXP au fost subclonate folosind site-uri de restricție BamHI/Xba I în pcDNA4HisMax, un vector pmCherry-C1 modificat (Clontech, Saint-Germain-en-Laye, Franța), precum și vectori de expresie pLuc și pYFP. Toate constructele au fost verificate prin secvențierea Sanger.

SDS-PAGE și western blot

Celulele HEK293 au fost transfectate cu concentrații echimolare de plasmide de expresie FOXP1 și cultivate timp de 48 de ore. Liza celulară, SDS-PAGE și western blot au fost efectuate așa cum s-a descris anterior. 19 membrane au fost sondate cu anti-EGFP de șoarece Clontech (pentru construcții de pYFP) peste noapte la 4 ° C, urmată de incubare cu IgG anti-șoarece de capră conjugat HRP timp de 45 de minute la temperatura camerei (Bio-Rad, Veenendaal, Olanda). Bloturile au fost colectate și retestate cu anticorp Sigma anti-β-actină pentru a confirma aceeași încărcare de proteine.

Microscopie fluorescentă

Celulele HEK293 și SHSY5Y au fost fixate pe o lamă de acoperire așa cum s-a descris anterior. 19 YFP și proteinele de fuziune mCherry au fost vizualizate prin fluorescență directă și nucleele au fost vizualizate folosind Hoescht 33342 (Invitrogen). Imaginile de fluorescență au fost obținute folosind un microscop de fluorescență Axiovert A-1 cu ZEN Image Software (Zeiss, Oberkochen, Germania).

Testele reporterului Luciferase

Testele de luciferază au fost efectuate așa cum s-a descris anterior. 19

Transfer de energie rezonantă bioluminiscentă (BRET)

Testele BRET au fost efectuate așa cum s-a descris anterior. 19, 20

Semnificație statistică

Semnificația statistică a testului reporterului luciferazei a fost analizată folosind analiza unică a varianței și testul post hoc al lui Tukey.

Rezultatul

Fenotip clinic

Pacienta este o femeie de paisprezece ani, primul copil născut al părinților fără convulsii. Mama ei avea 30 de ani, iar tatăl ei avea 32 de ani. S-a născut în secțiunea C din cauza oligohidramniosului și preeclampsiei și s-a constatat că are cordon ombilical cu membrană dublă și hipotensiune arterială severă la naștere. În primul an, a avut întârzieri motorii severe; a început să se târască la 12 luni și să meargă la 20 de luni. De asemenea, pacientul a întârziat vorbirea, primele cuvinte au început după 20 de luni. La vârsta de 3 ani, a fost diagnosticată cu o tulburare de comunicare expresivă și receptivă.

În prezent, doar 50% din discursul pacientului este coerent și nu poate susține conversația. Mai exact, discursul ei nu are structură, are conținut și distribuție limitate și repetă fraze simple (ecolalia). Metoda preferată de comunicare este de a trimite mesaje prin intermediul unui dispozitiv electronic. Pacientul a efectuat o evaluare slabă a limbii: 50 de puncte pentru o evaluare cuprinzătoare a limbii vorbite (

Imagine la dimensiune completă

Examinarea cu rezultate normale a inclus testarea genetică pentru distrofia musculară, tulburările mitocondriale, sindromul X fragil și microarrayul SNP. Studiile de electroencefalografie și conducere nervoasă au fost normale. Imagistica prin rezonanță magnetică efectuată la vârsta de 12 ani a evidențiat mai multe anomalii ale substanței albe subcorticale și profunde care nu se intensifică și o constatare accidentală a angiomului venos în lobul anterior stâng.

Varianta de novo a secvenței FOXP1 identificată prin secvențierea exoma

În cazuri rare de TSA, abordările recente de descoperire a genelor s-au concentrat pe identificarea variantelor de novo prin utilizarea secvențierii exomului complet într-un trio părinte-copil. Această strategie a avut succes în identificarea unei porțiuni substanțiale a riscului populației și în identificarea variațiilor care cauzează efecte biologice relativ mai mari. 21 Pentru a identifica variante putative care pot afecta funcția proteinelor, am efectuat, prin urmare, secvențierea clinică a exomului de 17 pe ADN de la probanzi și de la părinții lor, fără a-l afecta. Folosind această abordare, am identificat o deleție heterozigotă de novo cu două baze în FOXP1 prezentă în proband, care a fost ulterior validată și confirmată ca de novo prin secvențierea Sanger (Figura 1b). Varianta FOXP1 a fost trimisă la baza de date NCBI ClinVar (//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/; numărul de acces ClinVar SCV000189225).

Această variantă, c.1267_1268delGT (numerotată din primul nucleotid de codificare din NM_032682.5), este localizată în exonul 15 al FOXP1 (numerotat din NG_028243.1). Se așteaptă ca schimbarea să introducă o schimbare de cadru în proteina codificată, rezultând întreruperea prematură și pierderea domeniului de legare a ADN-ului și a semnalelor de localizare nucleară (NLS) (p.V423Hfs * 37 conform recomandărilor HGVS) (Figura 1c). În trecut, au fost raportate două variante trunchiate heterozigote de novo potențiale ale FOXP1 în cazuri de ASD (c.1014_1015insA (p.A339Sfs * 4)) și ID (c.1573C> T (p.R525 *)) cu vorbire și deficite de limbaj 14 16 (a se vedea Figura 1c pentru o comparație între cele trei variante de proteine ​​trunchiate FOXP1).

Deoarece varianta introduce un codon stop înainte de limita finală a exonului în FOXP1, transcriptul mutant poate suferi NMD. Prin urmare, am evaluat expresia transcrierilor FOXP1 în limfoblaste obținute de la probanzi. În condiții normale de cultură celulară, s-a constatat că numai alela WT este exprimată (Figura 1d). După inhibarea NMD, expresia atât a variantei, cât și a alelelor WT ar putea fi detectată, sugerând că transcrierile variantei sunt în general degradate de NMD (Figura 1d). Pentru a determina dacă oricare dintre variantele de transcriere a scăpat de acest proces, am efectuat RT-PCR cantitativ cu primeri specifici pentru alela variantei FOXP1 și am constatat că c.1267_1268dGG FOXP1 este exprimat la niveluri scăzute în limfoblastele obținute din probanzi (Figura 1e și imaginea suplimentară 1 ).

Caracterizarea funcțională a variantei secvenței FOXP1 în celulele umane

Pentru a examina efectele variantelor de transcripții NMD-escape, am efectuat o caracterizare funcțională a proteinei codificate de transcriptul mutat. Formele WT și variante ale FOXP1 au fost exprimate ca proteine ​​de fuziune YFP- sau mCherry în celulele HEK293. Varianta de proteină p.V423Hfs * 37 a fost exprimată la un nivel similar cu proteina WT, determinat prin Western blot (Figura 2a). Spre deosebire de FOXP1, care s-a localizat în nucleu, varianta p.V423Hfs * 37 fuzionată cu mCherry localizată în citoplasmă, în concordanță cu pierderea ambelor semnale de localizare nucleară (Figura 2b). Trebuie remarcat faptul că atunci când varianta p.V423Hfs * 37 a fost fuzionată cu YFP, a format agregate în citoplasmă (Figura 2 suplimentară). Rezultate similare au fost obținute prin examinarea localizării subcelulare a variantei FOXP1 în celulele neuroblastom SHSY5Y umane transfectate (Figura suplimentară 3). Lipsa unui domeniu de legare a ADN-ului FOX sugerează că este puțin probabil ca varianta FOXP1 să-și păstreze capacitatea de a lega ADN-ul. Testele reporterului Luciferase au demonstrat că varianta p.V423Hfs * 37 nu a reușit să reprime transcripția, în concordanță cu pierderea capacității de legare a ADN-ului (Figura 2c).

discuţie

Aici prezentăm un pacient cu o ștergere de novo 2-bp în FOXP1. Această modificare duce la degradarea transcrierilor variantei și codifică o proteină nefuncțională, sugerând că fenotipul pacientului va rezulta probabil din haploinergia FOXP1. Demonstrăm în continuare că un subset de transcripții ale variantei FOXP1 scapă de NMD și de sechestranții WT FOXP1 și FOXP2 din nucleu, sugerând că varianta p.V423Hfs * 37 poate avea un efect negativ dominant în traducere. În acest caz, efectele biologice s-ar datora unei combinații de mecanisme, principalul mecanism patologic fiind haploinformarea. Viitoarele studii de eliminare FOXP1 (de exemplu, folosind constructele shRNA) ar trebui să fie informative în evaluarea efectelor haploinsuficienței FOXP1 la nivel molecular.

Pacientul nostru împărtășește mai multe caracteristici fenotipice cu alți indivizi care poartă variante de FOXP1 care perturbă funcția proteinelor, inclusiv autism, ID, deficite severe de limbaj și macrocefalie. 7 Aceste observații sugerează că haploinsuficiența FOXP1 are ca rezultat un sindrom distinct care include aspecte ale ID și TSA, precum și alte simptome clinice. 7 Prin urmare, screening-ul țintit pentru variantele FOXP1 este justificat la probandii cu caracteristici clinice compatibile cu sindromul.

Deși vorbirea și limba au fost afectate la pacientul nostru, ea nu avea apraxia vorbirii pediatrice (dificultăți de coordonare a secvențelor complexe ale mișcărilor musculare orofaciale necesare vorbirii) și aceasta este cea mai importantă caracteristică în cazurile de mutații patogene FOXP2. 26, 27 La persoanele cu variante FOXP2, problemele de articulare a vorbirii sunt însoțite de tulburări în mai multe aspecte ale limbajului expresiv și perceptiv. 28, 29 La pacientul nostru, limbajul mai pronunțat a fost afectat mai semnificativ decât limbajul receptiv, în concordanță cu fenotipurile observate la alți indivizi cu variante ale pierderii funcției FOXP1. 7, 11, 14 Până în prezent, nu au fost observate variante ale FOXP1 care să provoace afectarea limbajului în absența unei disfuncții cognitive mai globale. 30 Diferențele observate între fenotipurile de haploinergie FOXP1 și FOXP2 pot reflecta diferențe în modelele de expresie neuronală 23, 24 și/sau reglarea țintelor din aval comune și nepartajate.

Investigația noastră oferă dovezi suplimentare că o proporție semnificativă a tulburărilor neurodezvoltării severe izolate poate fi rezultatul variantelor de novo. Acest studiu subliniază în plus importanța caracterizării experimentale a variantelor detectate prin secvențierea ADN-ului de generația următoare în înțelegerea rețelelor moleculare și celulare care sunt fundamentale pentru tulburările majore ale dezvoltării neurologice.