obiecte
abstract
Șoarecii C57BL/6 (B6) de la Taconic Sciences (Tac) și Jackson Laboratory (Jax) au fost infectați cu H. pylori PMSS1 (Hp) timp de 16 săptămâni; nu a existat nicio diferență semnificativă în activitatea histologică a stomacului între Tac infectat cu Hp și Jax B6. Cu toate acestea, gradul de metaplazie a mucoasei gastrice și nivelurile IgG2c asociate Th1 ca răspuns la infecția cu Hp a crescut la șoarecii Tac la șoarecii Jax, în timp ce nivelurile de colonizare gastrică Hp au fost de 8 ori mai mari comparativ cu Tac B6 la Jax B6. În plus, expresia mARN-ului gastric IL-1β, IL-17A și RegIIIγ a fost semnificativ mai mică la Tac-urile infectate comparativ cu șoarecii Jax infectați. Au existat diferențe semnificative în structurile comunităților microbiene din stomac, colon și scaun între femeile Jax și Tac B6. Se consideră că diferențele în comunitățile microbiene gastrice dintre femelele Jax și Tac B6 afectează metagenul. În plus, infecția cu Hp a perturbat structurile comunității microbiene din stomac, colon și fecale la șoareci Jax, dar a modificat doar compoziția microbiană a colonului la șoarecii Tac. Datele noastre arată că microbiomul GI al șoarecilor Tac B6 este diferit din punct de vedere compozițional de șoarecii Jax B6, ceea ce a dus probabil la diferite răspunsuri patologice, imunologice și microbiene la infecția cu Hp.
Infecția cu Helicobacter pylori poate provoca gastrită cronică activă, ulcer peptic și este un factor de risc major pentru dezvoltarea adenocarcinomului gastric 1, 2. Aproximativ 50% din populația lumii este infectată cu acest agent patogen,
10% dintre aceștia cauzează boală ulcerului gastric sau duodenal și
Șoarecii C57BL/6 afectați de Th1 au fost folosiți pentru a defini mecanismele carcinogenezei gastrice inflamatorii induse de infecția cu H. pylori 15. Diferiti microbioti ileali au fost observati la soareci C57BL/6 de la Jackson (Jax) si Taconic Bioscience (Tac) 16. În special, bacteriile filamentoase segmentate (SFB), un grup de bacterii gram-pozitive care formează spori, sunt prezente la șoarecii Tac, dar absenți la șoarecii Jax. SFB promovează răspunsurile proinflamatorii ale celulelor Th17 și joacă, de asemenea, un rol important în inducerea răspunsurilor IgA mucoasei 16, 17, 18, 19, 20, 21. Având în vedere rolul microbiomului și în special al SFB în modelarea răspunsurilor imune ale gazdei, am emis ipoteza că infecția cu H. pylori induce efecte patologice și răspunsuri imune diferențiate la șoarecii C57BL/6 cu diferiți microbieni gastro-intestinali care ar putea oferi noi perspective asupra efectelor diferiților microbiotați GI. asupra patologiei gastrice induse de H pylori la om. În acest studiu, severitatea patologiei gastrice, expresia mediatorilor inflamatori, a microbiomilor gastrointestinali (GI) (stomac, colon, fecale) și dinamica colonizării SFB ca răspuns la infecțiile cu H. pylori la șoarecii Jax și Tac C57BL/6 au fost caracterizate și comparat.
Rezultatul
Șoarecii Tac infectați cu H. pylori au dezvoltat metaplazie a mucoasei gastrice mai severe decât șoarecii H. infectați cu pylori.
La 16 săptămâni după inocularea H. pylori (16 WPI), infecția cu H. pylori a indus o patologie gastrică semnificativ mai severă atât la șoarecii Tac, cât și la șoarecii Jax B6 în comparație cu controalele lor simulate (Fig. S1, P 
Severitatea metaplaziei mucoasei a crescut la șoarecii H. infectați cu Tac B6 pylori comparativ cu omologii lor Jax. ( A ) Scorul (crescător de la 1 la 4) al metaplaziei mucoasei gastrice, care a fost mai severă la șoarecii Tac infectați. ( B ) Imagini reprezentative care prezintă trăsături patologice între grupuri.
Imagine la dimensiune completă
Pentru a caracteriza în continuare originea metaplaziei mucoasei, am examinat tiparele de expresie ale markerilor pentru metaplazie mucoasă (Tff2) și SPEM (Tff2, GSII-lectină) în țesuturile gastrice utilizând imunohistochimia 22, 23, 24. În corpusul gastric al controalelor Jax și Tac, expresia foarte ușoară a Tff2 a fost limitată la celulele mucoasei cervicale și la selecția glandei bazale, în timp ce la șoarecii infectați cu H. pylori, creșterea și imunomarcarea de novo a glandelor hiperplazice și metaplastice și/sau godeurilor foveolare s-au observat focare care s-au răspândit pe toată lungimea mucoasei (fig. 2A). În plus, expresia Tff2 a fost mai pronunțată în stomacul șoarecilor infectați cu H. pylori comparativ cu șoarecii infectați cu Jax, în principal în segmente care au suferit metaplazie mucoasă, care se corelează cu metaplazia mucoasă crescută observată la șoarecii infectați cu Tac. În mod similar, mai multe glande GSII-pozitive au fost observate în stomacul controalelor de la ambii furnizori (Fig. 2B). În contrast, expresia gastrică GSII-lectină a fost semnificativ crescută la toți șoarecii infectați comparativ cu martorii neinfectați. Mai mult, expresia GSII-lectină a fost crescută în Tac B6 infectat comparativ cu Jax B6 infectat cu H. pylori (Fig. 2B).
Expresia Tff2 și GSII a fost crescută în infecția cu corp gastric a Tac B6 comparativ cu omologii lor Jax. ( A ) Tff2 IHC a ( B ) Imunofluorescența GSII.
Imagine la dimensiune completă
Gradele de colonizare gastrică H. pylori au fost semnificativ mai mari la șoarecii Jax comparativ cu șoarecii Tac
Șoarecii C57BL/6 cu vârsta potrivită au fost infectați cu H. pylori PMSS1 timp de 16 săptămâni. Toți șoarecii Jax infectați au fost pozitivi pentru H. pylori, în timp ce 4 din 10 șoareci Tac infectați au fost negativi pentru H. pylori (Fig. 3A). În plus, nivelul mediu de colonizare gastrică H. pylori au fost de 8 ori mai mari la șoarecii Jax (3317 ± 1345) comparativ cu nivelul la șoarecii Tac H. pylori-pozitivi (452 ± 219) fără semnificație statistică (Fig. 3A, P = 0,064).
Prezența SFB ileal a fost documentată pentru a induce un răspuns Th17 robust 16. Astfel, nivelurile de transcriere ale tuturor genelor testate pe țesuturile gastrice au fost, de asemenea, măsurate în ileonul atât al șoarecilor infectați, cât și al șoarecilor martor. Nivelurile de transcript IL-17A și Ifnγ au fost semnificativ crescute la șoarecii Tac comparativ cu șoarecii Jax (Fig. S2). Nivelurile de ARNm Ileal Tnfa, Il-1p, Il-22, Il-10, Foxp3 și RegIIIy au fost comparabile între șoarecii Tac și Jax, indiferent de starea infecției.
Infecția cu H. pylori a crescut semnificativ nivelurile de colonizare SFB la colonul șoarecilor Tac B6
Folosind qPCR 26 specific SFP, am monitorizat nivelurile fecale de SFB în timp la șoareci Jax și Tac și am măsurat, de asemenea, dinamica colonizării SFB în ileon, apendice și colon. Toți șoarecii Jax au fost SFB negativi în țesuturile analizate. Viceversa. SFB-urile au fost prezente în fecale și ileon la toți șoarecii Tac, iar șoarecii selectați au fost pozitivi pentru SFB în colon și cecum (Fig. 4). După o săptămână în care șoarecii Tac B6 au fost adăpostiți în MIT, nivelurile de SFB fecale fecale au fost semnificativ reduse comparativ cu nivelurile post-sosire (Fig. 4A). Ulterior, nivelurile SFB au scăzut treptat de la 2 la 16 WPI. Infecția cu H. pylori nu a modificat semnificativ nivelurile de SFB fecale, cu excepția a 4 WPIs, în timp ce infecția cu H. pylori a crescut semnificativ nivelurile de SFB fecale.
Când diversitatea beta a fost analizată folosind UniFrac neponderată, flora microbiană din fiecare sit eșantionat a fost grupată în principal de către furnizor (Fig. 5). Analiza PCoA arată că în stomac (P
Comparația structurilor microbiene ale stomacului, colonului și scaunului între șoarecii Jax și Tac B6. Analiza principală a coordonatelor (PCoA) (UniFrac neponderată) a fost efectuată pe baza secvențelor genice bacteriene 16S rRNA la aceeași adâncime a probei (2743). Probele de la șoareci Jax (portocaliu) și Tac (roșu) sunt prezentate sub formă de cercuri colorate. Valorile P sunt calculate pe matricea distanțieră UniFrac corespunzătoare neponderată utilizând testul ADONIS și 14, în timp ce un alt studiu a raportat că doar grupurile selectate de bacterii, dar nu structurile comunitare microbiene gastrice generale ale șoarecilor femele Tac B6, au fost perturbate semnificativ de H, infecție pylori 30. Evaluarea efectului infecției cu H. pylori asupra diversității alfa la șoareci a arătat că infecția cu H. pylori nu a modificat diversitatea din stomac, colon sau scaun a șoarecilor Tac sau Jax. În timp ce infecția cu H. pylori nu a modificat semnificativ diversitatea la șoarecii B6, analizele PCoA (UniFrac neponderată utilizând testul ADONIS) au arătat că infecția cu H. pylori a modificat semnificativ structurile microbiene din stomac, colon și fecale la șoarecii Jax B6 (P
Tabel în dimensiune completă
discuţie
Șoarecii C57BL/6 (B6) au fost folosiți pe scară largă în cercetarea biomedicală datorită cunoașterii aprofundate a profilului genetic și a utilizării lor într-un număr de tulpini de șoarece transgenice. În acest studiu, am demonstrat că există răspunsuri diferite la infecția cu H. pylori la șoareci femele B6 obținute din Laboratorul Jackson (Jax) împotriva Biosciences Taconic (Tac). Șoarecii infectați Jax B6 au avut niveluri mai ridicate de colonizare gastrică H. pylori, transcrierea crescută a Il-1β gastric și Il-17A în comparație cu omologii Tac infectați. În plus, a existat o metaplazie a mucoasei gastrice mai severe și un răspuns mai puternic IgG2c asociat Th1 la H. pylori la șoarecii infectați Tac B6 comparativ cu șoarecii infectați Jax B6. Mai mult, datele microbiomului au arătat că abundența și uniformitatea compozițiilor microbiene din stomac, colon și scaun diferă semnificativ între tulpinile Jax și Tac B6. Infecția cu H. pylori a modificat semnificativ structurile comunității microbiene la toate locurile testate (stomac, colon și fecale) la femelele Jax B6, dar a modificat doar structurile comunității microbiene din colonul omologului Tac. Aceste descoperiri indică faptul că o anumită tulpină de șoarece cu microbieni diferiți poate dezvolta răspunsuri imune diferite ale gazdei și modificări patologice induse de H. pylori. .
SFB la șoarecii Tac B6 din studiul nostru a susținut și a colonizat predominant ileonul, indiferent de starea infecției, care a fost asociată cu o creștere de peste 100 de ori a ARNm ileal IL-17A, dar nu și a ARNm Tnfa și IL-1β comparativ cu ambii H. șoarecii infectați pylori și șoarecii martor Jax. Nivelurile de ARNm ileal Ifnγ au fost, de asemenea, crescute la toți șoarecii Tac B6, care pot face parte din răspunsul gazdei la menținerea homoeostaziei populației de celule Th17. Cu toate acestea, metaplazia mucoasei gastrice mai severe și reducerea H. Nivelurile de colonizare Pylori la șoarecii Tac B6 nu păreau să fie direct din cauza prezenței SFB, deoarece nivelurile gastrice de ARNm de IL-17A erau comparabile între șoarecii Tac B6 și martorii Jax B6. Cu toate acestea, infecția cu H. pylori a crescut nivelurile de colonizare SFB în colon, în concordanță cu constatările noastre anterioare la șoarecii Tac Swiss Webster infectați cu H. hepaticus 26. Deoarece celulele Th17 pot acționa ca o apărare a gazdei împotriva infecției unei game largi de microorganisme patogene 40, SFB poate juca un rol important în formarea și menținerea structurilor microbiene gastrointestinale la șoarecii Tac B6 care au fost compozițional diferiți de cei de la șoarecii Jax B6. Afectează indirect răspunsurile patologice și imunologice ale șoarecilor Tac B6 la infecțiile cu H. pylori .
În general, am arătat că șoarecii B6 de la Jax și Tac conțin structuri comunitare microbiene diferite și dezvoltă răspunsuri imunitare, patologice și microbiene diferențiale la infecțiile cu H. pylori. Diferențele în microbiomii GI între șoarecii Jax și Tac B6 pot rezulta din diferite practici de creștere a locuințelor între vânzători, precum și din variațiile fenotipice și genetice dintre aceste sub-tulpini C57BL/6 29, 41. Interacțiunea dintre H. pylori și microbiota GI și rezultatul patologic rezultat devin din ce în ce mai evidente atât la șoareci, cât și la oameni. Descoperirile noastre subliniază în plus importanța definirii sursei modelelor animale utilizate într-un studiu special dat fiind că aceeași tulpină consangvinizată a șoarecelui poate avea comunități microbiene GI diferite, care pot dicta răspunsuri diferite la un tratament experimental dat.
Materiale și metode
Șoareci și infecție
Șoarecii au fost întreținuți într-o unitate acreditată de Asociația pentru evaluarea și acreditarea îngrijirii animalelor de laborator. Toate procedurile experimentale și de îngrijire a animalelor au fost aprobate de Comitetul Institutului de Tehnologie din Massachusetts pentru îngrijirea și utilizarea animalelor, în conformitate cu Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator. Cincisprezece șoareci femele C57BL/6 (B6) de 4 săptămâni au fost cumpărate de la Taconic Biosciences (Tac) (Germantown, NY) și, respectiv, de la Jackson Laboratory (Jax) (Bar Harbor, ME). Șoarecii nu aveau virusuri murine cunoscute, Helicobacter spp. și paraziți și au fost menținuți în cuști de microizolatori statici și au primit o dietă (ProlabRMH3000) de la PMI Nutrition International (Richmond, IN ) . După o săptămână în carantină, 10 șoareci de la fiecare furnizor au fost inoculați cu H. pylori PMSS1 (care conține un CagA funcțional), unde 5 șoareci de control din fiecare furnizor, care erau adăpostiți într-o cabină separată, au fost dozați în mod fals cu vehiculul. Șoarecii au primit 0,2 ml de inocul proaspăt (
2 × 10 8 organisme) prin gavaj gastric la fiecare două zile pentru un total de trei vaccinări.
Necropsie și histopatologie
Probele fecale de la fiecare șoarece B6 au fost colectate înainte de inoculare, la 2, 4, 8 și 16 săptămâni după inocularea cu H. pylori (WPI). Toți șoarecii infectați și de control din fiecare grup au fost eutanasiați la 16 WPI. Imediat după eutanasierea șoarecilor cu CO 2, au fost colectate și prelucrate probe de stomac din curbura mai mică care se extind din pădurea scuamoasă prin duoden proximal, așa cum s-a descris anterior 31, 42. Leziunile gastrice au fost clasificate de un patolog comparativ (S. Muthupalani) orbit pentru a identifica eșantionul pe o scară ascendentă de la 0 la 4 pentru inflamație, defecte epiteliale, atrofie, hiperplazie, metaplazie pseudopilorică, displazie și metaplazie mucoasă definite în altă parte 31. Un indice de activitate histologică gastrică (GHAI) a fost generat prin combinarea scorurilor pentru toate criteriile. În plus, joncțiunea cecocolică și colonul au fost încorporate în parafină, secționate la 5 µm și colorate cu hematoxilină și eozină pentru evaluarea histologică utilizând același sistem de notare ca cel descris anterior 43 .
Prepararea ADN-ului și ARN-ului din probe de țesut și fecale
Conținutul din stomac și intestin a fost îndepărtat prin clătire cu PBS steril. O bucată de țesut gastric care conține antrum și corp și segmente de un cm de ileon, cec și colon pentru izolarea ARN-ului sau ADN-ului au fost colectate și congelate în azot lichid imediat după prelevare și depozitate la -70 ° C înainte de utilizare. ADN-ul total din țesuturile și probele fecale colectate a fost izolat folosind trusa de pregătire a șabloanelor de înaltă puritate PCR (Roche, Applied Science, Indianapolis, IN) și folosind QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit conform protocolului furnizorului (Qiagen Inc. CA), respectiv. ARN-ul total din țesuturile gastrice și intestinale a fost izolat folosind reactivi Trizol în urma procedurii furnizorului (Invitrogen, Carlsbad, CA). Puritatea ADN-ului sau ARN-ului preparat au fost analizate folosind Nanodrop 2000C (Thermo Scientific, Wilmington, DE).
imunohistochimie
Secțiunile de stomac din toate grupurile au fost colorate cu iepuri policlonali specifici anti-Tff2 IgG 22. În plus, celulele mucoasei gastrice gastrice au fost identificate utilizând griffonia (Bandeiraea) simplifolia lectin II (GSI) conjugată cu fluoresceină izotiocianat (FITC) și lamele au fost montate cu Vectashield plus DAPI (4, 6-diamidino-2-fenilindol) (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Imunohistochimia de rutină a fost efectuată așa cum s-a descris anterior cu modificări minore 22. Antigenele au fost recuperate la un pH scăzut și ridicat, în funcție de anticorpi, prin incubare timp de 45 de minute la 95 ° C, iar lamele au fost colorate folosind un colorant automat (Lab Vision Autostainer 360; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA) folosind secvențial un bloc de peroxidază Ultravision de 10 minute, un bloc de rozătoare R de 30 de minute, anticorpi primari timp de 30 de minute, urmat de IgG anti-iepure pe bază de polimer secundar adecvat și dezvoltat cu diaminobenzidină și contracolorat cu H&E. Diapozitivele au fost deshidratate și curățate și apoi acoperite pentru evaluarea calitativă a modelelor de expresie ale diferiților markeri.
ELISA
Metodele utilizate au fost publicate anterior 12 .
Secvențierea și analiza genei ARNr 16S
Exprimarea citokinelor selectate
Pentru cuantificarea relativă a ARNm a genelor selectate, ARN-ul total din stomac și ileon al șoarecilor B6 a fost preparat folosind reactivul Trizol conform recomandărilor producătorului (Invitrogen, Carlsbad, CA). Cinci μg de ARN total din fiecare probă au fost transformate în ADNc folosind trusa de arhivă de ADNc de mare capacitate (Life Technologies). Nivelurile de ARNm Ifnγ, Tnfα, Il-1β, Il-17A, Il-22, RegIIIγ, Il-10 și Foxp3 în țesuturile gastrice și ileale au fost măsurate prin qPCR folosind primerii și sondele comerciale (teste de expresie genică TaqMan) în 7500 Sistem RAPID PCR în timp real. Nivelurile de transcriere au fost normalizate la controlul endogen gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază mARN (Gapdh) și exprimate ca schimbare de ori în raport cu controalele simulate (definite ca 0) folosind metoda comparativă a ciclului de prag (CT) (Applied Biosystems User Bulletin No. ).
analize statistice
Date privind nivelurile de SFB, H. expresia pylori și citokine au fost analizate între mai multe grupuri utilizând un test Kruskal-Wallis și între două grupuri utilizând un test t neparticipat. Testul Mann-Whitney U a fost utilizat pentru analiza scorurilor GHAI între grupuri. Valorile P