obiecte

abstract

Principalul

Majoritatea femeilor diagnosticate cu cancer ovarian, care sunt tratate conform protocoalelor standard, vor muri de boala lor 1 și s-a înregistrat o îmbunătățire minimă a rezultatelor în ultimele două decenii. S-au făcut progrese în îmbunătățirea criteriilor morfologice pentru subtiparea cancerelor ovariene, iar reproductibilitatea diagnosticului a fost recent crescută la un nivel excelent de reproductibilitate. 5, 5 5 subtipuri majore de cancer ovarian (seros, clar, endometrioid, mucinos și seros), care pot fi identificate pe baza criteriilor morfologice, variază în funcție de factorii genetici de risc, leziunile precursoare, modificările moleculare la etapa de prezentare și comportamentul clinic, 3, 5, 6, 7 și sunt cel mai bine considerați ca entități diferite ale bolii. Datorită diferențelor de chimiosensibilitate între subtipurile de cancer ovarian, există o cerere de studii clinice specifice subtipului pentru a identifica terapii mai eficiente pentru acele subtipuri (adică celule limpezi, mucinoase) rezistente la chimioterapia convențională cu platină/taxan. 9, 10, 11

predicția

Recent, s-a demonstrat că chimioterapia neoadjuvantă urmată de o intervenție chirurgicală de debulching produce rezultate similare cu chimioterapia postoperatorie la pacienții cu cancer ovarian avansat cu avantajul morbidității reduse, a timpului chirurgical scurtat și a recuperării postoperatorii mai rapide. Chimioterapia neoadjuvantă este eficientă pentru cancerele foarte seroase, dar nu și pentru altele. Atunci când chimioterapia neoadjuvantă este administrată numai unui subtip specific de cancer ovarian, aceasta ridică întrebări cu privire la cât de fiabil poate fi diagnosticat subtipul pe probe limitate, cum ar fi probele de biopsie nucleară sau biopsia cu ac fin. Deși reproductibilitatea excelentă este posibilă atunci când diagnosticul se bazează pe examinarea mai multor diapozitive dintr-o tumoare bine recoltată4, nu există dovezi că o reproductibilitate similară este posibilă pe baza unui eșantion mic de tumoră. Am arătat recent că subtipurile majore ale cancerului ovarian diferă semnificativ în ceea ce privește profilul lor de expresie a biomarkerului 8, sugerând că expresia biomarkerului poate fi utilă în diagnosticarea subtipurilor. Prin urmare, am căutat cel mai mic grup de biomarkeri imunohistochimici care au arătat cea mai mare sensibilitate și specificitate pentru diagnosticul celor cinci subtipuri majore de cancer ovarian.

Materiale și metode

Declarație etică

Aprobarea utilizării acestor grupuri pentru acest studiu a fost obținută de la Consiliul de Cercetare pentru Etică al Agenției pentru Cancer din Columbia Britanică și Universitatea din Columbia Britanică.

Grupuri de studiu și criterii de incluziune

Acest studiu folosește trei cohorte independente, două pentru a genera ecuații predictive și una pentru a valida aceste ecuații predictive (Figura 1).

Proiectarea experimentală a studiului descrie în detaliu descoperirea independentă a unui panou imunohistochimic de markeri din două cohorte fără legătură, acuratețea predicției reprezentată de valoarea statistică κ (κ) și validarea internă.

Imagine la dimensiune completă

Prima cohortă, denumită în continuare cohorta de arhivă, conținea un total de 500 de țesuturi parafinice de carcinom ovarian fixat în formalină dintr-o cohortă retrospectivă descrisă anterior, bazată pe populația din Columbia Britanică diagnosticată între 1984 și 2000. spitale., fără standardizarea fixării sau prelucrării probelor. Criteriul primar de eligibilitate a fost diagnosticul cancerului ovarian chemonic, pacienții fiind eliberați de boala reziduală macroscopică după o intervenție chirurgicală citoreductivă primară, rezultând nicio boală reziduală macroscopică. Această definiție a cazului a dus la un număr relativ mare de cancere non-seroase, comparativ cu ceea ce se așteaptă dintr-o serie cuprinzând toți pacienții cu cancer ovarian. 6

Al doilea grup, denumit în continuare cohorte de bănci tumorale, a constat dintr-un set de cazuri de bănci de țesuturi ginecologice la spital la Vancouver General Hospital și a constat din 292 de probe de la pacienți diagnosticați cu cancer ovarian între 2001 și 2008. Aceste probe reprezintă țesut de calitate cu timp scurt de devitalizare și fixare și procesare standardizată a țesuturilor.

Al treilea grup, denumit în continuare cohorta de validare, a fost compus din cazuri diagnosticate progresiv de cancer ovarian observate în cinci centre din Canada și a inclus probe prelevate din 2006 până în 2009 care au făcut parte dintr-un studiu histomorfologic recent. 4

Clasificarea tumorii

Toate diapozitivele histologice au fost examinate patologic (CBG și MK) și atribuite unuia dintre cele cinci subtipuri majore (seroase, clare, endometrioide, mucinoase, seroase, seroase) sau altele (inclusiv cancere mixte și tipuri rare, cum ar fi tumora Brenner nediferențiată, scuamoasă, malignă, neclasificat) conform criteriilor modificate ale OMS descrise recent. 3, 7 Carcinoamele cu un model de creștere tranzitorie la o examinare cu putere redusă, dar alte caracteristici ale carcinomului seric de înaltă calitate, cum ar fi spațiile fisurate sau un model microcistic, au fost clasificate ca o variantă a carcinomului seros de înaltă calitate, i. carcinom seros (cu semne tranzitorii). Toate cazurile diagnosticate ca „altele” (adică nu unul dintre cele cinci subtipuri majore de cancer ovarian) au fost excluse din acest studiu. În plus, a fost necesar un acord între observatori cu privire la diagnosticul subtipului histologic între cei doi patologi evaluatori. Au fost excluse cazurile de neconformitate (N = 98 din 873 de cazuri din trei serii de cazuri (11, 2%)). În cele din urmă, numai cazurile în care au fost disponibile date complete pentru toate imunostainele au fost supuse analizei statistice (N = 138 din 775 (17,8%) nu au avut date complete pentru toți cei 22 de markeri și au fost excluși).

Selecția mărcii

imunohistochimie

Trei microarrays de țesut au fost construite așa cum este descris mai sus 13 din regiuni tumorale reprezentative folosind o matrice de țesut (Beecher Instruments, Silver Spring, MD, SUA și Pathology Devices, Westminster, MD, SUA). Două miezuri de 0,6 mm diametru au fost îndepărtate din fiecare bloc donator și transferate în blocul receptor.

Secțiunile cu o grosime de 4 μm au fost tăiate și colorate în decurs de 2 săptămâni după tăiere. Detaliile anticorpilor din setul final de nouă markeri și procedurile de colorare sunt prezentate în Tabelul 1. Independent, doi patologi (MK sau BG) au evaluat vizual acești biomarkeri din imagini digitalizate (scaner BLISS, Bacus Laboratories/Olympus America, Lombard, IL, SUA ). Toți biomarkerii au fost evaluați ca fiind pozitivi sau negativi, utilizând o limită pozitivă de> 1% din celule (Figura 2), cu excepția CDKN2A, pentru care colorarea pozitivă a fost definită ca> 75% din celulele tumorale cu colorare citoplasmatică și nucleară puternică ca definit. anterior, 24 și TP53, unde a fost utilizat un sistem de notare în trei pași (absență completă - scor 0, 1-50% - scor 1 și> 50% - scor 2) datorită dovezilor că scorurile 2 și 0 se corelează cu mutațiile de bază, în timp ce scorul 1 se corelează cu tipul sălbatic TP53 25 (Figura 3). Mai puțin de 5% din cazuri au prezentat rezultate inconsistente între cei doi patologi care au obținut scoruri și au fost utilizate scoruri mai mari pentru aceste cazuri.

Tabel în dimensiune completă

Imunostainele reprezentative pentru DKK1, HNF1B, MDM2, PGR, TFF3, VIM, WT1. Decupările dintre negativ (scor 0) și pozitiv (scor 1) sunt indicate printr-o linie verticală groasă.

Imagine la dimensiune completă

Imunostainele reprezentative pentru CDKN2A și TP53. Decupările sunt indicate printr-o linie groasă. Pentru CDKN2A, un scor de 0 este negativ sau slab colorare pozitivă, în timp ce o colorare pozitivă puternică este un scor de 1. TP53 a fost evaluat utilizând un sistem de scor în trei părți: 0-negativ, 1-slab pozitiv, 2-pozitiv. Pentru detalii despre notare, consultați Materiale și metode.

Imagine la dimensiune completă

analize statistice

Analiza de așteptare și statistica Pearson 2 (cu valori P neajustate) au fost folosite pentru a testa heterogenitatea expresiei pentru fiecare biomarker între arhiva și cohortele tumorale din fiecare subtip. Modelarea siglei de regresie reală utilizând un model de model a fost utilizată pentru a crea ecuații predictive care încep pe întregul panou de 22 de markeri. Criteriul de excludere pentru un anumit marker s-a bazat pe cea mai mare valoare P din testul raportului de probabilitate. Pentru predicțiile modelului, zona caracteristică a receptorului receptorului sub curbă (ASC)> 0,95 a fost definită ca rezultatul dorit pentru fiecare tip histologic în scopul acestui studiu.

Validarea ecuațiilor predictive a fost efectuată prin aplicarea unui panou imunohistochimic final la cohorta de validare pentru a crea subtipuri histologice previzionate care ar fi comparate cu consensul subtipului histopatologic. Subtipul pe care modelul îl consideră cel mai probabil, chiar dacă probabilitatea a fost de 27

Rezultatul

Parametrii clinici de bază și diagnosticele de subtip evaluate morfologic pentru arhivă, bănci de tumori și fișiere de validare sunt enumerate în Tabelul 2. Datorită cerinței unui rezultat de colorare interpretabil pentru toți cei 22 de imunomarcatori, numerele finale pentru generarea ecuației de predicție 314 au fost pentru grupul de arhivă. și 242 pentru cohorta băncii tumorale. Nu a existat nicio diferență între cazurile incluse și cele excluse pe baza frecvenței subtipului tumoral.

Tabel în dimensiune completă

Atât pentru cohorte de arhivă, cât și de bănci de tumori, panoul original de 22 de markeri care au fost diferențați în subtipurile de cancer ovarian a fost supus unei adaptări complete a modelului, regresie logistică nominală treptat utilizând eliminarea din spate. Criteriul de oprire pentru procesul de eliminare înapoi a fost de a se asigura că caracteristica de funcționare a receptorului sub curbă (ROC AUC) a fost ≥0,95 pentru fiecare subtip. Acest proces iterativ a furnizat același panou de nouă markeri independent pentru cohorta atât a arhivei cât și a tumorii bănci (Figura 1). Ambele ecuații au fost utilizate pentru a prezice subtipul histologic în cohortele lor respective utilizând sensibilitatea, specificitatea, caracteristica de funcționare a receptorului sub curbă (ROC AUC) și coeficientul K al lui Cohen (κ). În general, ecuațiile au realizat o treabă excelentă predicând atribuțiile consensului subtipului atât pentru arhivă (κ = 0, 88 ± 0, 02), cât și pentru băncile de tumori (k = 0, 86 ± 0, 04) (Tabelele 3 și 4).

Tabel în dimensiune completă

Tabel în dimensiune completă

Acuratețea predicției de grad scăzut a fost testată prin aplicarea ambelor ecuații de predicție la un set de 10 tumori limită seroase și a arătat că ecuația de predicție arhivistică a clasificat 9 din 10 cazuri drept serot cu serie redusă, dintre care unul a fost clasificat ca fiind mare. - ser seros, în timp ce ecuația băncii tumorale a clasificat 1 din 10 cazuri ca carcinom seros de grad scăzut, 3 din 10 ca serot seros și 6 din 10 cazuri ca endometrial. Aceste rezultate ne-au determinat să obținem ecuația de predicție a băncii tumorale și să creăm o nouă ecuație de predicție pentru această cohortă bazată doar pe patru subtipuri (seroase, cu celule clare, endometriide, mucinoase), adică să nu încercăm să facem distincția între boala seroasă și cea de nivel înalt . grad seros. Acest lucru a avut un efect redus asupra preciziei de predicție pentru celelalte patru subtipuri (Tabelul 5).

Tabel în dimensiune completă

Modelele au fost apoi validate încrucișat față de cea de-a doua cohortă (Tabelul 6). Pentru a determina diferența dintre ecuațiile de predicție pentru cohorte de arhivă și tumori, am efectuat teste de eterogenitate specifice din punct de vedere histologic pentru fiecare marker din testul și cohorta de validare. Acest lucru a arătat o tendință spre antigenicitate redusă în grupul de arhivă comparativ cu cohorta clinică și este cel mai bine ilustrat, de exemplu, prin frecvențele de colorare HNF1B în endometrioide, celule limpezi și subtipuri mucinoase (Tabelul 7). În schimb, PGR în gradul ridicat de subtip seros a prezentat frecvențe de colorare diferite în direcția opusă, cu 35, 8 și 19,1% din cazuri în arhivă și grupurile bancare tumorale exprimând PGR (P

Grafice de regresie logistică care indică o proporție tot mai mare de diagnostice clinice corecte cu probabilitate crescută. ( A ) Predicția arhivistică asupra cohortei arhivistice, ( b ) predicția arhivelor în cohorta băncilor de tumori, ( c ) predicția băncii de tumori pe cohorta de arhivă, ( d ) predicția băncii tumorale pentru cohorte de bănci tumorale, ( e ) predicția băncii tumorale asupra cohortei de validare, ( f ) arhivarea predicțiilor asupra cohortei de validare.

Imagine la dimensiune completă

Am investigat profilurile de predicție pentru cazurile excluse de cancer nediferențiat și neclasificat. Ambele ecuații de predicție au clasificat 9 din 9 cazuri de carcinom nediferențiat ca fiind un tip seros de înaltă calitate. Cinci cazuri de carcinom neclasificat s-au prezis a fi seros foarte seros (3) și mucinos (2) folosind ecuația de predicție arhivistică și endometrioid (2), seros de înaltă clasă (1) și mucinos (2) predicție bancară de tumori. ecuaţie. Toate cele patru cazuri de carcinom seros cu funcții tranzitorii (așa cum sunt definite în secțiunea Materiale și metode) au fost clasificate ca fiind extrem de seroase în mod serios prin ambele ecuații de predicție.

discuţie

În acest studiu, am dezvoltat un grup de imunomarcatori care pot prezice cu precizie un subtip de cancer ovarian. Acest panou de markeri este ușor de aplicat în practică, oferind suport molecular obiectiv pentru clasificarea cancerelor ovariene, consolidând astfel clasificarea histopatologică tradițională.

Tipurile de cancer ovarian diferă în ceea ce privește leziunile precursoare, comportamentul clinic, modificările moleculare și expresia biomarkerilor. 7, 8 În ceea ce privește cancerele de sân, în care imunomarcatorii contribuie la diagnosticul precis al subtipurilor tumorale și pot fi folosiți pentru a ghida luarea deciziilor terapeutice, 28 de tipuri specifice de tratament tumoral au fost, de asemenea, propuse pentru cancerul ovarian. De exemplu, la femeile diagnosticate cu carcinoame mucoase sau cu celule limpezi, chimioterapia poate fi ineficientă, în timp ce femeile cu carcinoame seroase avansate de grad înalt pot beneficia de chimioterapie neoadjuvantă. Integrarea descoperirilor moleculare în clasificarea cancerelor ovariene are potențialul de a crește reproductibilitatea și precizia diagnosticului, care va deveni din ce în ce mai important în viitor. De exemplu, în terapia neoadjuvantă, care va deveni o opțiune de tratament pentru cancerul ovarian avansat, va fi necesară o tipare precisă pe biopsii de bază sau specimene de citologie înainte de tratament.

Punctele forte ale studiului includ utilizarea a două cohorte independente mari, dintre care una avea o proporție mai mare de subtipuri minoritare (celule clare, endometriale și mucinoase); aceleași nouă panouri de marcare au fost derivate de la 22 de creatori candidați în mod independent în aceste două cohorte. De asemenea, a fost utilizată o a treia cohortă de validare independentă, formată din cazuri care reprezintă frecvența subtipurilor în practică. 4, 6 „Standardul de aur” morfologic realizat prin selectarea cazurilor în care doi patologi ginecologi specialiști au fost de acord în mod independent asupra unui diagnostic de subtip, au asigurat că diagnosticul de caz în toate cele trei serii de cazuri a fost consecvent și cât mai exact posibil. Mai mult, într-un efort de a asigura reproductibilitatea, ne-am limitat markerii candidați IHC la cei în care ar putea fi folosiți anticorpi disponibili comercial și sisteme simple de notare.

O altă limitare a acestui studiu este lipsa capacității modelului băncii de tumori de a distinge între carcinom seros de grad scăzut și carcinom seros de grad înalt. Carcinoamele serice de calitate scăzută reprezintă 3% din cancerele ovariene 6, ceea ce face dificilă obținerea unor cazuri suficiente pentru dezvoltarea modelului. Carcinoamele serice cu carcinom seric de nivel scăzut provin din multe cazuri în tumorile serice de frontieră, mai degrabă decât în ​​carcinomul tuberculos seros intraepitelial, nu sunt asociate cu mutații germinale sau mutații somatice BRCA1/2 sau mutații TP53, adesea au mutații BRAF sau KRAS. Și nu au mutații. ele răspund, de asemenea, la chimioterapia pe bază de platină ca carcinoame foarte seroase. Deși carcinoamele de grad scăzut și carcinoamele de serotină de grad înalt pot fi diagnosticate din nou atunci când sunt disponibile probe mari de țesut pentru examen histopatologic, diferența dintre carcinomul de grad scăzut și carcinomul seros de grad înalt la specimenele mici este problematică și este necesară o lucrare suplimentară pentru dezvoltat. biomarkeri pentru a ajuta la acest diagnostic diferențial special.

Imagine a calculatorului web de predicție a subtipului de cancer ovarian (COSP). COSP poate fi utilizat pentru ceea ce am considerat material „de arhivă” sau „bancă de tumori”. Depinde de utilizator să stabilească ce ecuație este cea mai potrivită pentru eșantioanele lor. COSP poate fi utilizat într-un singur regim sau ca regim discontinuu pentru a permite analiza cohortelor retrospective de țesuturi mari cu date înregistrate în format tabelar.

Imagine la dimensiune completă

Tastarea sofisticată care reflectă biologia tumorală de bază și se corelează cu răspunsul la terapie va ajuta la îmbunătățirea managementului clinic la femeile diagnosticate cu cancer ovarian.