cardiomiopatia

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Subiecte și metode
  • obiecte
  • Secvențializare absolut excelentă
  • Mutageneza controlată a filaminei C complete
  • Cultură celulară și imunofluorescență
  • Analiza Western blot și extracția secvențială a proteinelor cu detergent
  • imunohistochimie
  • Rezultatul
  • discuţie

obiecte

  • Cercetări genetice
  • Secvențierea noii generații

abstract

La marea majoritate a pacienților pediatrici cu cardiomiopatie dilatată, etiologia specifică este necunoscută. Studiile cu familii cu cardiomiopatie dilatată ilustrează rolul factorilor genetici în etiologia cardiomiopatică. În acest studiu, am aplicat secvențierea absolut excelentă la membrii unei familii dezarticulate afectate de un sindrom de cardiomiopatie dilatată congenitală nedeclarată anterior care necesită transplant precoce de inimă. Analiza exomomului a identificat variante heterozigote ale compusului din gena FLNC. Analiza histologică a mușchiului cardiac a arătat anomalii sarcomerice și miofibrilare semnificative, iar colorarea imunohistochimică a arătat prezența agregatelor de filamină C în miocitele cardiace. Concluzionăm că variantele bialelelice din FLNC pot provoca cardiomiopatie dilatată congenitală. Deoarece semnele clinice asociate ale pacienților afectați sunt ușoare și pot fi ușor trecute cu vederea, copiii cu cardiomiopatie dilatată ar trebui luați în considerare pentru testarea FLNC. .

Subiecte și metode

obiecte

A ) Pedigree familial care demonstrează vârsta indivizilor și segregarea alelelor FLNC mutante. Alela FLNC de tip sălbatic este marcată cu un semn plus. Simbolurile completate indică persoanele afectate. Liniile diagonale prin simboluri indică decedatul. b ) Conservarea evolutivă a domeniului FLNC, care conține varianta F106L missense (roșu), la diferite vertebrate (compararea și protecția vertebratelor, compararea și protecția condițiilor, browserul genomului UCSC). c ) Electroferograme care prezintă mutații FLNC la pacient și părinții lor. Versiunea color a acestei imagini este disponibilă în Jurnalul European de Genetică Umană online.

Imagine la dimensiune completă

Secvențializare absolut excelentă

Extracția ADN genomic, îmbogățirea exoma, secvențierea și analiza au fost finalizate așa cum s-a descris mai sus. 3 variante au fost filtrate pentru a crea o listă finală doar cu variante funcționale rare (lipsă de sens, prostii, variante ale site-ului de îmbinare și indels). Variantele cu o frecvență de alelă mai mică> 0,01 în serverul Exome Variant (versiunea ESP6500) sau cele cu un număr de alele> 150 în baza de date a eșantioanelor europene (NFE) ExAC au fost eliminate. Analizele de validare și segregare au fost efectuate așa cum a fost descris. 3 variante au fost evaluate în raport cu secvențele de referință stocate la Centrul Național pentru Informații despre Biotehnologie (FLNC: NM_001458.4). Datele variante au fost trimise către ClinVar (SUB1474516; //www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/).

Mutageneza controlată a filaminei C complete

O clonă ADNc de lungime completă pentru FLNC (NM_001458.4) cu un N-terminal Myc-DDK-Tag a fost obținută de la OriGene (Rockville, MD, SUA). Mutageneză direcționată la fața locului a fost efectuată pentru a genera clone cu variantele p.F106L, p.R991 *, utilizând kitul de mutageneză direcționat la fața locului QuikChange II XL conform recomandărilor producătorului (Stratagene, Santa Clara, CA, SUA) și oligonucleotide specifice (pentru c.318C> G, p. (F106L), înainte - 5'-GCCCTCGAGTTgCTCGAGCGCGA-3 'și invers - 5'-TCGCGCTCGAGcAACTCGAGGGGC-3'; pentru c.2971C> T, p. (R991 *), înainte - 5 ' -CTGGGGGGA 3 'și înapoi - 5'-GCCAGCCCCTCaTGTGTTCACAG-3'; pentru F106L-s, 5'-ATGAGCACCAAGTGCG-3 '; Introducerea variantei corecte și absența altor variante a fost verificată prin secvențierea Sanger.

Cultură celulară și imunofluorescență

Analiza Western blot și extracția secvențială a proteinelor cu detergent

Celulele au fost nucleofectate cu 2 μg din fiecare plasmidă și analizate în prezența proteinei la 48 de ore după transfecție. Pentru extracția proteinelor, celulele cultivate au fost spălate de două ori cu 1 x PBS și lizate în tampon RIPA (100 mM Tris-HCI (pH 8,0), 150 mM NaCl, 10 m EDTA, 1% deoxicolat de sodiu, 1% Triton X -100, 0, 1% SDS) suplimentat cu un cocktail complet de inhibitor de protează fără EDTA și PhosStop EASYpack (Roche). Lizatele celulare au fost centrifugate la 13.000 g timp de 5 minute și supernatantul a fost salvat. Concentrația de proteine ​​a fost evaluată prin tehnica acidului bicinchoninic (Pierce BCA Protein Assay Kit, Waltham, MA, SUA). Proteinele au fost folosite pe geluri SDS-PAGE de 8%, transferate în membrane de nitroceluloză, blocate cu lapte praf degresat 5% în tampon TBS-T (20 mM Tris (pH 7, 4), 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20) și incubat peste noapte la 4 ° C cu următorii anticorpi primari: anticorp anti-DDK (Cell Signaling, Beverly, MA, SUA) și anti-actină (Sigma, St. Louis, MO, SUA). Anticorpii primari au fost detectați cu anticorpi secundari specifici speciilor conjugate cu peroxidază de hrean (Jackson Immunoresearch (West Grove, PA, SUA) sau Thermo Scientific (Waltham, MA, SUA)) cu substrat Luminata Forte Western HRP (Millipore, Billerica, MA, SUA ). ) folosind LAS-300 FUJIFILM (Tokyo, Japonia).

imunohistochimie

Rezultatul

Un studiu comparativ al hibridizării genomice nu a arătat nicio modificare a numărului de copii. În plus, întreaga secvențiere a exoma a fost efectuată pe proband, pe asistenta sa de 16 ani și pe părinții lor. Secvențierea a fost efectuată folosind un Illumina HiSeq 2500 (San Diego, CA, SUA) pentru a genera rezultate asociate de 150 bp cu o acoperire medie de 95 ×. Rezultatele exacte au fost analizate pentru toate regimurile de moștenire și au dezvăluit un compus heterozigot al variantelor missense și stop-gain în gena FLNC: g. [128471009C> G]; [128484099C> T]. Prima variantă de sens, c. [318C> G], p. (F106L), conform bazei de date ExAC (//exac.broadinstitute.org), a fost găsit de patru ori la 32.261 de europeni și a fost moștenit de la mama sa. Fenilalanina în această poziție este foarte conservată în evoluție (Figura 1b) (GERP + = 4, 5, phyloP100way = 3, 2, 5, 6) și s-a prezis că va interfera cu toți algoritmii preziși investigați (SIFT, Polyfen2, LRT, VariantTaster, VariantAssessor, FATHMM). A doua variantă, c. [2971C> T], p. (R991 *), este o variantă stop-gain/prostie care nu a fost încă listată în nicio bază de date și a fost transferată de la tată. S-a constatat că variantele din FLNC se separă așa cum era de așteptat în familie. Analiza unui eșantion de ADN frate decedat a relevat aceeași heterozigoitate a compusului pentru variantele FLNC (Figurile 1a și c).

Deoarece variantele heterozigote din FLNC au fost asociate cu miopatii miofibrilare și distale, 7, 8, 9, 10, 11, evaluarea neurologică a fost efectuată la toți membrii familiei care s-au dovedit a fi purtători de variante (șapte subiecți; vârstele 5-72). Ani). Examinările neurologice și ecocardiogramele au fost normale la toți subiecții.

Imagine la dimensiune completă

discuţie

În cele din urmă, recomandăm ca testarea cu filamină C să fie luată în considerare la copiii cu cardiomiopatie dilatată. Diagnosticul molecular precoce este important pentru predicția, tratamentul și prevenirea insuficienței cardiace care progresează rapid și a aritmiilor care pun viața în pericol.