obiecte
abstract
Tendoanele sunt țesuturi conjunctive dense, compuse în principal din colagen de tip I, care transmit forțe între mușchi și os și sunt necesare pentru structura locomotorie.
Diabetul zaharat de tip II (T2DM) este o boală metabolică caracterizată prin hiperglicemie și sensibilitate scăzută la insulină 1 și este puternic asociată cu obezitatea 2. Deși este dificil să rupi efectele sistemice ale diabetului de tip II de obezitate, este clar că inducerea obezității/T2DM duce la modificări severe ale funcției metabolice, ducând la diferite modificări patologice în întregul corp 3 .
În prezent, se știe foarte puțin despre mecanismele celulare și moleculare care stau la baza tendinopatiei diabetice, deși modificările patologice cresc în funcție de durata T2DM 6. Pentru a începe abordarea acestei lacune de cunoștințe, am folosit un model de șoarece de obezitate indusă de dietă și diabet de tip II 14 pentru a testa ipoteza că tendoanele flexoare la șoarecii obezi/diabetici vor fi modificări progresive, patologice în funcția articulației tendonului și proprietăți mecanice. De asemenea, am investigat efectele funcției metabolice normale asupra recuperării ca potențial mijloc de inversare sau oprire a tendinopatiei diabetice. În cele din urmă, datorită pierderii sensibilității la insulină observată la tendoanele obeze/T2DM, am generat receptori de insulină specifici tendonului (IR) condiționați la șoareci knock-out pentru a determina dacă deleția IR din tendon este suficientă pentru recapitularea fenotipului tendinopatiei diabetice.
Rezultatul
HFD induce obezitatea și diabetul de tip II la șoareci
Șoarecii HFD au avut o creștere semnificativă a greutății corporale comparativ cu LFD și HFD-LFD în toate momentele (24 săptămâni - LFD: 33, 75 g ± 2, 27, HFD: 49, 05 g ± 2, 24; HFD-LFD: 28, 8 g ± 7,03, p 
T2DM/obezitatea modifică funcția tendonului și proprietățile mecanice. ( A ) Măsurarea unghiului de îndoire a articulațiilor articulației metacarfalangiene (MTP), ( B ) Rezistență la alunecare, ( C ) Sarcina maximă de eșec și ( D ) Rigiditatea tendonului FDL în tendoanele LFD, HFD și HFD-LFD între 12 și 48 de săptămâni după începerea dietei. * Indică p
T2DM/obezitatea modifică diametrul fibrilelor de colagen. ( A ) Imagini axiale TEM ale tendonului FDL de la șoareci LFD, HFD și HFD-LFD la 40 de săptămâni după începerea dietei. Depunerile lipidice din tendoanele HFD sunt indicate de săgeți negre. Scara reprezintă 5 microni în imagini de mărire 3500x și 0,5 microni în imagini de mărire 40.000x. ( B ) Histogramele cu diametrul fibrilei de colagen care arată o reducere a diametrului median al fibrilei în tendoanele HFD și HFD-LFD comparativ cu LFD. ( C ) Distribuții ale diametrului fibrilelor de colagen cu fuziuni ale graficului cutiei care se suprapun între datele dintre percentilele 5 și 95. Datele din afara acestui interval sunt reprezentate ca puncte individuale. ( D ) Densitatea fibrilelor de colagen. * Denotă p15 Am examinat modificările activării semnalizării receptorului de insulină (IR) în tenocitele primare și tendoanele obeze/T2DM și non-diabetice de șoarece. Tenocitele primare demonstrează activarea robustă a semnalizării IR, așa cum se indică prin creșterea expresiei β-Akt comparativ cu tenocitele tratate cu vehiculul (Fig. 4A). După stimularea insulinei, tendoanele de la șoareci LFD au demonstrat o inducție puternică a expresiei β-Akt, indicând activarea semnalizării IR. În schimb, inducția p-Akt a fost tocită în tendoanele HFD (Fig. 4B).
Expresia și semnalizarea receptorilor de insulină sunt modificate la tendoanele diabetice. ( A ) Tenocitele primare izolate din tendoanele non-diabetice ale șoarecilor demonstrează o expresie puternică a β-Akt în raport cu tenocitele tratate cu vehicul, indicând activarea semnalizării IR în tenocite. ( B ) Tendoanele de la șoareci HFD și LFD au fost stimulate cu insulină sau vehicul (0,5% BSA în PBS). Activarea semnalizării IR a fost observată în tendoanele LFD datorită expresiei crescute a β-Akt. În contrast, nu s-a observat nicio creștere a expresiei β-Akt în tendoanele HFD stimulate de insulină comparativ cu tratamentul vehiculului, indicând sensibilitate amorțită la insulină în tendoanele HFD. Bloturile au fost sondate pentru β-Akt și afișate, după dezbrăcarea membranei, aceleași bloturi au fost apoi sondate pentru Akt total. Blocurile de lungime completă sunt prezentate în Figura 1 suplimentară.
Imagine la dimensiune completă
S100a4-Cre are ca rezultat o scădere a expresiei receptorului de insulină în tendon
Datorită pierderii sensibilității la insulină la tendoanele obeze/T2DM de șoarece și la creșterea expresiei IRp la tendoanele T2DM umane, am examinat efectele ștergerii IRp la tendoane folosind S100a4-Cre. Pentru a demonstra că S100a4-Cre vizează în mod eficient tenocitele rezidente, S100a4-Cre +; Au fost folosiți șoareci reporteri Ai9. Expresia fluorescenței A19 a fost observată în aproape toate tenocitele rezidente (Fig. 5A). În plus, analizele Western blot au arătat o reducere a expresiei IRp în S100a4-Cre +; Șoareci IR F/F (IRcKO S100a4), în comparație cu frații standard (WT) (Fig. 5B). Nu au fost observate modificări ale procentului de grăsime corporală (Fig. 5C), greutatea corporală (Fig. 5D) sau glicemiei la jeun (Fig. 5E) între șoarecii WT și IRcKO S100a4. O creștere tranzitorie a toleranței la glucoză a fost observată la șoarecii IRcKO S100a4 la 30 de minute după administrarea bolusului de glucoză, dar nu s-a observat nicio diferență de toleranță la glucoză după 15, 60 sau 120 de minute (Fig. 5F). O scădere semnificativă de 23% a zonei de sub curbă a fost observată la șoarecii IRcKO S100a4 în timpul testului de toleranță la glucoză (Fig. 5G). Astfel, IRcKO S100a4 permite investigarea efectelor specifice ale IRP knock-down în tendonul independent de obezitate/T2DM.
Ștergerea IRp în celulele S100a4 nu induce obezitate sau T2DM. ( A ) Eficiența recombinării S100a4-Cre în tendoane a fost vizualizată folosind reporterul A19 și a demonstrat recombinarea eficientă în tendon. ( B IRcKO S100a4 reduce expresia proteinei IRp în tendon, comparativ cu WT. Blocurile de lungime completă sunt prezentate în figura suplimentară 2. ( C - E ) Nu au fost observate modificări ale greutății corporale între șoarecii WT și IRcKO S100a4 ( C ), ( D ) procentul de grăsime corporală sau din sânge ( E ) în sânge de post după 48 de săptămâni. Vârstă. ( F - G ) IRcKOS100a4 a avut o recuperare mai eficientă a nivelului sanguin în timpul testului de toleranță la glucoză ( F ) și calculat prin cuantificarea ariei de sub curbă de la testul de toleranță la glucoză ( G ).
Imagine la dimensiune completă
Ștergerea receptorului de insulină în celulele liniei S100a4 nu induce tendinopatie diabetică
Tendoanele IRcKO S100a4 au avut o creștere semnificativă a unghiului de flexie MTP (49, 87 ° ± 1, 79, p = 0,02) după 48 de săptămâni față de WT (42, 37 ° ± 2, 16) (Fig. 6A). Nu s-a observat nicio modificare a rezistenței la alunecare între WT și IRcKO S100a4 (WT: 19, 02 ± 2; 1; IRcKO S100a4: 17, 73 ± 1, 87, p> 0,05) (Fig. 6B). Sarcina maximă de eșec și rigiditate nu a diferit semnificativ între tendoanele IRcKO S100a4 și WT (Sarcină maximă: WT: 5, 92 N ± 0, 74, IRcKO S100a4: 6, 9 N ± 0, 7, p = 0, 36) (Fig. 6C, D). În plus, analizele TEM arată că pierderea IRp în celulele S100a4 nu a modificat distribuția diametrului fibrilei de colagen (WT mediană: 188, 63; IRCKO S100a4: 193, 32, p = 0,21 mediană) (Fig. 6E-G) sau fibrilele de densitate (Fig. 6H) (p = 0, 82) la vârsta de 48 de săptămâni.
Ștergerea IRp în celulele descendente S100a4 nu perturbă funcția tendonului glisant, proprietățile mecanice sau organizarea colagenului. ( A ) MTP ROM, ( B ) Rezistență la alunecare, ( C ) Max. Sarcina de eșec și ( D ) Rigiditatea a fost evaluată la vârsta de 48 de săptămâni la tendoanele WT și IRcKO S100a4. * Indică p S100a4 la vârsta de 48 de săptămâni. ( F ) Nu s-au observat modificări ale diametrului fibrilelor de colagen între tendoanele WT și IRcKO S100a4. ( G ) Distribuții ale diametrului fibrilelor de colagen cu fuziuni ale graficului cutiei care acoperă date între percentilele 5 și 95. Datele din afara acestui interval sunt reprezentate ca puncte individuale. ( H ) Densitatea fibrilelor de colagen ale imaginilor TEM ale tendoanelor de șoarece WT și IRcKO S100a4 la vârsta de 48 de săptămâni.
Imagine la dimensiune completă
discuţie
Proprietățile mecanice ale tendonului și ale ROM depind de organizarea colagenului ECM 20. Datorită scăderii proprietăților mecanice ale tendoanelor de la șoarecii HFD și HFD-LFD, am examinat modificările în organizarea colagenului și diametrul fibrilelor. TEM a arătat modificări semnificative în distribuția diametrului fibrilelor de colagen în tendoanele HFD și HFD-LFD comparativ cu LFD. Aceste modificări observate în dimensiunea fibrilelor pot afecta funcția tendonului glisant și sugerează o arhitectură modificată a fibrilelor de colagen ca mecanism al funcției tendinoase afectate în tendinopatia diabetică. În consecință, o creștere a volumului tendonului este observată clinic la pacienții cu diabet zaharat de tip II 21, sugerând că pierderea compactității colagenului poate interfera cu funcția normală de alunecare care duce la scăderea funcției tendonului și a gamei de mișcare.
Pe scurt, obezitatea/T2DM este suficientă pentru a induce o cascadă ireversibilă de modificări patologice în tendonul flexor, inclusiv organizarea modificată a ECM, care duce în cele din urmă la proprietăți mecanice reduse și la tendonul ROM. În plus, ștergerea IRp în celulele S100a4 nu modifică organizarea tendonului ECM sau funcția tendonului. Având în vedere că sensibilitatea redusă la insulină este observată la tendoanele obeze/T2DM, va fi importantă investigarea în continuare a rolului IRp în alte populații de celule. În cele din urmă, diferențierea disfuncției metabolice nu a fost suficientă pentru a preveni progresia bolii tendinoase, sugerând că înțelegerea celulelor specifice tendonului și răspunsul molecular la obezitate/T2DM vor fi cruciale pentru gestionarea cu succes și tratamentul tendinopatiei diabetice.
metode
Etica animalelor
Acest studiu a fost realizat în strictă conformitate cu recomandările Manualului Institutului Național de Sănătate pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor de Laborator. Toate procedurile la animale au fost aprobate de Comitetul Universitar pentru Cercetarea Animalelor (UCAR) de la Universitatea din Rochester (numărul UCAR: 2014-004).
Obezitate indusă de dietă și diabet de tip II
Șoarecii masculi C57B1/6J (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) au fost adăpostiți în grupuri de cinci pe un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore. După patru săptămâni, șoarecii au fost puși pe o dietă cu conținut scăzut de grăsimi (LFD; 10% Kcal, Research Diets # 12450 J) sau cu o dietă bogată în grăsimi (HFD; 60% Kcal, Research Diets # D12492) timp de până la 48 de săptămâni. O a treia cohortă (HFD-LFD) de șoareci a fost plasată pe HFD timp de 12 săptămâni și apoi schimbată în LFD până la sacrificiu (Fig. 1A). Șoarecii au fost sacrificați la 12, 24, 40 și 48 de săptămâni după începerea dietei, prin inhalarea dioxidului de carbon și luxarea colului uterin.
Receptorii insulinei au mediat ștergerea șoarecilor
Pentru a controla pierderea IRp în nobilime, IRp phlox/flox (# 6955, Jackson Laboratories) 29 au fost încrucișate cu șoareci S100a4-Cre (# 12641, Jackson Laboratories) pentru a obține șoareci IRcKO S100a4. co- fabricat; Frații IRp flox/flox au fost folosiți ca controale de tip sălbatic (WT). Pentru a confirma țintirea eficientă a tendonului, șoarecii S100a4-Cre au fost încrucișați cu șoareci reporteri Ai9 (# 7909, Jackson Laboratories) 30, rezultând fluorescența tdTomato după recombinare mediată de Cre. Șoarecii au fost sacrificați la vârsta de 48 de săptămâni.
Măsurarea glucozei în post
La 12, 24, 40 și 48 de săptămâni după începerea dietei, șoarecii (n = 6 pe dietă și punct de timp) au fost postite timp de cinci ore 31, au fost cântărite și au fost măsurate nivelurile de glicemie în repaus folosind un glucometru OneTouch2 (LifeScan Inc., Milpitas, CA). Glicemia în jeun a fost măsurată la vârsta de 48 de săptămâni la șoarecii IRcKO S100a4 și WT (n = 6 pe genotip).
Test de toleranță la glucoză
Pentru a determina toleranța la glucoză la 20 de săptămâni după începerea dietei, șoarecii LFD, HFD și HFD-LFD (n = 6 pe dietă) au primit un bolus de 10 μl/g de glucoză 20% în PBS prin injecție intraperitoneală rapid după cinci ore. Nivelurile de glucoză din sânge au fost măsurate la 15, 30, 60 și 120 de minute după bolusul de glucoză. Toleranța la glucoză a fost evaluată la vârsta de 48 de săptămâni la șoarecii IRcKO S100a4 și WT.
Evaluarea grăsimii corporale
La 12 și 48 de săptămâni după începerea dietei (vârsta de 48 de săptămâni la șoarecii IRcKO S100a4 și WT), procentul de grăsime corporală a fost măsurat utilizând un absorbant de raze X cu energie duală PIXImus (DXA) (GE Lunar PIXImus, GE Healthcare, WI ). ).
Evaluarea funcției navei
După sacrificiu, membrele posterioare au fost colectate pentru alunecare și testare biomecanică la 12, 24, 40 și 48 de săptămâni după începerea dietei (n = 6 - 10 per dietă per punct de timp). Șoarecii IRcKO S100a4 și WT au fost colectați la vârsta de 48 de săptămâni (n = 8-10). Tendonul FDL a fost izolat de joncțiunea miotendinoasă în tunelul de herpes tarsian, lăsând tendonul intact prin cifre. Capătul proximal al tendonului a fost fixat între două bucăți de bandă folosind cianoacrilat. Tibia a fost asigurată de propria aderență și capătul proximal al FDL a fost încărcat incremental de la 0 la 19 g. După aplicarea fiecărei greutăți, a fost luată o imagine a flexiei articulației metatarsofalangiene (MTP) și măsurată folosind ImageJ (//imagej.net). Folosind aceste cifre, unghiul de îndoire MTP este calculat ca diferența în unghiul de îndoire MTP între descărcat (0 g) și 19 g. Rezistența la alunecare a fost calculată prin plasarea datelor de deviere într-o ecuație exponențială monofazată. Regresia neliniară a fost utilizată pentru a determina rezistența la alunecare 32 .
Testarea biomecanică la tracțiune
După testarea funcției de alunecare, FDL a fost eliberat din tunelul tarsian și tibia a fost îndepărtată. Capătul proximal al FDL și cifrele au fost ținute în autoprinderi opuse într-un instrument Instron (sistemul de testare servohidraulică axială Instron 8841 DynaMight, Instron Corporation, Norwood, MA). Tendonul a fost deplasat în tensiune la 30 mm/minut până la eșec. Rigiditatea și sarcina maximă de eșec au fost calculate din curba de deplasare a forței.
Microscopie electronică de transmisie
Tendoanele FDL au fost izolate (n = 3 pe dietă sau genotip) și fixate în fixator de glutaraldehidă cacodilat de sodiu. O secțiune axială de un micron a fost tăiată și colorată cu albastru de toluidină. O secțiune de microni a fost apoi tăiată la 70 nm și colorată cu acetat de uranil și citrat de plumb. Secțiunile au fost plasate pe grile de imagine pe un TEM analitic Hitachi 7650. Au fost luate opt până la douăsprezece imagini care nu se suprapun din substanța mijlocie a fiecărui tendon la o mărire de 15.000x și 40.000x. Pentru a măsura diametrul fibrilelor, a fost determinată o zonă de interes (ROI) în fiecare imagine, astfel încât să poată fi măsurată minimum 80 de fibrile. Mediile au fost măsurate de-a lungul axei y. Densitatea colagenului a fost măsurată într-o zonă de 2340 x 1860 pixeli. Măsurările densității și diametrului fibrilelor de colagen au fost efectuate în ImageJ.
Exprimarea și semnalizarea receptorului de insulină
Tenocitele primare au fost izolate de la șoareci C57B1/6 J și utilizate până la pasajul 3. FT întregi au fost izolate de la șoareci HFD și LFD hrăniți la 48 de săptămâni după începerea dietei (n = 3 pe grup). Tenocitele și tendoanele au fost stimulate fie cu vehicul (0,5% BSA în PBS), fie cu insulină 1 nM timp de 15 minute, urmată de izolarea proteinelor pentru analizele Western blot. Bloturile au fost testate pentru fosfo-AKT Ser473 (1: 1000, Cell Signaling, # 4060) și pentru AKT total (1: 1000, Cell Signaling, # 9272 S) 33 și dezvoltate cu SuperSignal West Pico sau substrat chemiluminiscent Femto și afișate pe GelDocXR (BioRad, Hercules, CA). Pentru a evalua modificările expresiei IRp la șoarecii IRcKO S100a4, proteina totală a fost extrasă din tendoanele WT și IRcKO S100a4 (n = 3 pe genotip) pentru analizele Western blot. Bloturile au fost sondate cu IRp (1: 300, Santa Cruz, # sc-20739) 34 și β-actină (1: 2500, Sigma Aldrich, # A2228) 35 și s-au dezvoltat cu SuperSignal West Pico sau substrat chemiluminiscent Femto și au fost realizate pe GelDocXR ( BioRad, Hercules, CA).
Analize statistice
În studiile privind obezitatea/T2DM, greutatea corporală, nivelurile de glucoză din sânge, datele biomecanice și glisante au fost analizate prin analiza bidirecțională a varianței (ANOVA) urmată de comparația multiplă a Bonferroni cu semnificația stabilită la a = 0,05. TEM și procentul de grăsime corporală au fost analizate prin ANOVA unidirecțională cu comparații multiple post-hoc Bonferroni. Diferențele statistice între WT și IRcKO S100a4 au fost determinate folosind teste t nepereche. Toate datele au fost analizate cu software-ul statistic Prism GraphPad 7.0. Datele sunt prezentate ca medie ± SEM.
Disponibilitatea datelor
Acest articol include toate datele generate sau analizate în timpul acestui studiu.
Mulțumiri
Dorim să mulțumim histologiei, biochimiei și imagisticii moleculare (HBMI) a nucleului și biomecanicii, biomaterialelor și imagisticii țesuturilor multimodale (BBMTI) ale nucleului de la Centrul de cercetare musculo-scheletică, nucleul de imagistică multiphoton și nucleul de microscopie electronică de la Universitatea din Rochester Medical. Centrul de Asistență Tehnică. Această lucrare a fost susținută de granturile NIH/NIAMS K01AR068386 (AEL), P30 AR061307 Pilot (AEL), R01 AR073169 (AEL), R01 AR070765 (MRB) și Rochester University Research Award (AEL & MRB). KM a fost acceptat de 3T32 AR053459-10S1. Nucleul imagistic histologic, biochimic și molecular (HBMI) și biomecanica, biomaterialele și imagistica țesutului multimodal (BBMTI) Core sunt parțial susținute de P30 AR069655. Conținutul este responsabilitatea exclusivă a autorilor și nu reprezintă neapărat opiniile oficiale ale Institutelor Naționale de Sănătate.
Material suplimentar electronic
Informatii suplimentare
Comentarii
Prin trimiterea unui comentariu, sunteți de acord să respectați Termenii și condițiile și Regulile comunității. Dacă considerați că acesta este un act ofensator care nu este conform cu termenii sau liniile directoare, vă rugăm să îl marcați ca fiind inadecvat.