endocannabinoizii

  • obiecte
  • abstract
  • obiective:
  • Subiecte și metode:
  • rezultatele:
  • concluzie:
  • introducere
  • Subiecte și metode
  • obiecte
  • Cultură de celule sau grăsimi
  • Extracția ARN și PCR cantitativă în timp real (RTQ-PCR)
  • Determinarea concentrației de ApN în mediu de către RIA
  • imunoanaliză AMPc
  • Western blot
  • Prezentarea rezultatelor și analiza statistică
  • Rezultatul
  • Efectul blocării CB1R asupra expresiei genei adipokinei în explante cultivate
  • Efectul blocării CB1R asupra adipokinelor din adipocitele mature și SVC
  • Mecanisme implicate în reglementarea ApN ES
  • discuţie

obiecte

  • Reglarea genelor
  • Obezitatea
  • Hormoni peptidici

abstract

obiective:

(1) Pentru a investiga dacă modularea receptorului canabinoid tip 1 (CB1R) reglementează în mod direct producția de adiponectină (ApN) și alte adipokine în țesutul adipos omental (OAT) al indivizilor obezi, (2) pentru a determina în ce fracție celulară de OAT efectele blocadei apar CB1R și (3) pentru a dezvălui mecanismele de bază.

Subiecte și metode:

OAT a fost obținut de la 30 de indivizi obezi (indicele de masă corporală: 40, 6 ± 1, 3 kg m-2) supuși unei intervenții chirurgicale abdominale. Au fost utilizate culturi primare de explante sau adipocite proaspăt izolate sau celule vasculare stromale (SVC).

rezultatele:

În explicațiile OAT, blocatorul CB1R Rimonabant a reglat expresia genei ApN. Nivelul de ARNm al omentinei, care prezintă proprietăți sensibilizante la insulină, a fost, de asemenea, crescut. În schimb, nivelurile de ARNm a două citokine pro-inflamatorii, proteina inflamatorie macrofagă (MIP) -1β și interleukina (IL) -7, au fost reduse. Am investigat în continuare unde au apărut aceste efecte în cadrul OAT. Expresia CB1R a fost similară în ambele fracții celulare. În adipocitele mature izolate, blocarea CB1R a blocat o creștere a ARNm ApN și o scădere a ARNm IL-7, inducând în același timp o creștere a secreției ApN în mediu. În SVC izolat, expresia genei omentinei, care este limitată la această fracție, a fost crescută, în timp ce expresia MIP-1β a fost scăzută. În cele din urmă, am descifrat mecanismele care conduc la reglarea ApN de către sistemul endocannabinoid (ES). Am constatat mai întâi că reglarea ApN a fost de fapt mediată de CB1R: expresia genei ApN a fost reglată de Rimonabant și reglată în jos de agonistul CB1R arahidonil-2-cloretilamida (ACEA). Reglarea în sus a ApN de către Rimonabant nu a fost modificată prin inhibarea producției de AMPc. Cu toate acestea, reglarea descendentă a ApN de către ACEA a fost complet inversată de inhibitorul proteinei kinazei p38 activat de mitogen (p38MAPK) și ACEA a crescut fosforilarea p38MAPK.

concluzie:

Blocarea CB1R atenuează starea inflamatorie în ambele fracții de celule OAT, fie prin creșterea producției de ApN și omentină, fie prin scăderea ARNm-ului MIP-1β și IL-7. Reglementarea CE a ApN implică parțial p38MAPK.

Obezitatea este caracterizată local prin inflamația țesutului adipos și neregularizarea producției de adipokine cu secreție excesivă de peptide de reglare dăunătoare și hiposecreție de peptide defensive precum adiponectina (ApN). 1, 2 O astfel de dereglare declanșează dezvoltarea unei stări pro-inflamatorii sistemice de grad scăzut, care este considerată a construi un teren comun pentru dezvoltarea comorbidităților obezității și a sindromului metabolic. 1, 3, 4 Pentru acest profil de sănătate nefavorabil, acumularea preferențială de grăsime centrală în loc de grăsime subcutanată pare a fi un factor de risc mai puternic. 1

Sistemul endocannabinoid (ES), format din receptorul canabinoid tip 1 (CB1R) și liganzi derivați din lipidele endogene, modulează homeostazia energetică prin efecte centrale orexigenice și efecte metabolice periferice asupra mai multor organe, inclusiv țesutul adipos, unde stocarea energiei este crescută. 5, 6 Indivizii obezi prezintă niveluri mai ridicate de endocannabinoizi în grăsimea și serul visceral decât martorii slabi 7, 8 și prezintă, de asemenea, niveluri mai ridicate de endocannabinoizi în grăsimea viscerală decât în ​​grăsimea subcutanată. 9 Prin urmare, activarea puternică a CE ar putea fi considerată ca o forță motrice care duce sau este legată de obezitatea centrală. 10

Tratamentul pacienților obezi cu blocant selectiv CB1R Rimonabant a promovat o reducere semnificativă a greutății corporale și a circumferinței taliei (un indicator al adipozității abdominale), precum și o îmbunătățire a factorilor de risc cardiovascular și metabolic. 11 Unele dintre aceste îmbunătățiri au fost atribuite creșterii nivelurilor circulante de ApN. Această creștere a fost parțial independentă de pierderea în greutate și a sugerat o îmbunătățire specifică a funcției țesutului adipos. 12

În concordanță cu această observație, Rimonabant a crescut expresia ApN în țesutul adipos al rozătoarelor tratate in vivo, precum și în linia de adipocite 3T3-F442A murină in vitro. Cu toate acestea, efectele periferice ale canabinoizilor au fost slab studiate în țesutul adipos uman. Mai multe rapoarte au dat date controversate despre eliberarea de adipokine din celulele adipoase umane. 14, 15, 16 Aceste experimente au fost efectuate pe adipocite diferențiate in vitro de precursorii stromali, care au fost izolați în principal din grăsimea subcutanată a indivizilor non-obezi, 15, 16 supuși apoi la doze farmacologice de cocktailuri adipogene. Cu toate acestea, grăsimea omentală mai degrabă decât cea subcutanată, precum și obezitatea sunt asociate cu sindromul metabolic și tonusul endocannabinoid anormal. În plus, diferențierea adipocitelor în contextul in vivo împreună cu interacțiunile celulare conservate poate fi o condiție prealabilă pentru exprimarea optimă a genei adipokinei. 17

Pe lângă reglarea în jos a ApN, am arătat, ca alții, că unele adipokine sunt supraexprimate de țesutul adipos omentic (OAT) al persoanelor obeze și ar putea contribui, de asemenea, la tulburări metabolice și cardiovasculare. 18 Atât adipocitele, cât și celulele vaselor stromale (SVC; adică celulele fără grăsime) contribuie la dereglarea adipokinei în obezitatea umană. 18 Cu toate acestea, potențialul rol direct al CE în CCR nu a fost niciodată abordat. Mecanismele care stau la baza reglementării potențiale a adipokinelor CE sunt încă în curs de investigare.

Scopul acestui studiu a fost (1) de a evalua dacă modulația CB1R reglează în mod direct producția de ApN și alte adipokine în OAT la indivizii obezi, (2) de a determina în ce fracțiune celulară a blocajului OAT CB1R apare și (3) de a dezlega mecanismele de bază.

Subiecte și metode

obiecte

OAT a fost obținut de la 30 de indivizi obezi supuși unei intervenții chirurgicale bariatrice (gastroplastie cu bandă verticală) după un post peste noapte (Tabelul 1). Pacienții nu au fost tratați cu hormoni (de exemplu, glucocorticoizi; altele decât insulina pentru unul dintre ei), antiinflamatoare nesteroidiene sau alte medicamente despre care se știe că afectează masa grasă sau metabolismul (de exemplu, tiazolidindione, modulatori sistemici și nespecifici). receptori adrenergici).

Tabel în dimensiune completă

Sângele a fost extras de la fiecare pacient înainte de operație. Așa cum se arată în Tabelul 1, acești pacienți erau sever obezi, aveau tensiune arterială sistolică mai mare, glicemie în repaus alimentar, niveluri de colesterol lipoproteice cu densitate scăzută și niveluri de proteine ​​C reactive decât cele recomandate sau normale, iar femeile aveau niveluri mai scăzute de colesterol lipoproteice cu densitate ridicată . Opt pacienți au fost diagnosticați ca diabet de tip 2 și au fost tratați cu dietă și/sau antidiabetice orale sau insulină pentru unul dintre ei. Două treimi dintre pacienți au îndeplinit criteriile pentru sindromul metabolic, definite de declarația științifică comună. 19

Au fost utilizate explante sau celule de la un singur subiect pentru fiecare cultură. Datorită disponibilității limitate a țesuturilor, nu toate datele ar putea fi obținute de la toți pacienții.

Protocolul de studiu a fost aprobat de comitetul local de etică al Cliniques Universitaires Saint-Luc.

Cultură de celule sau grăsimi

Am folosit protocoale stabilite pentru a studia producția de adipokine de către fragmente sau celule izolate din OAT. 18, 20, 21 În aceste condiții experimentale, nici fracționarea țesuturilor, nici cultura în sine nu au modificat nivelurile de expresie a adipokinei. 18

Extracția ARN și PCR cantitativă în timp real (RTQ-PCR)

ARN total din celule sau țesuturi a fost extras folosind reactivul de izolare TriPure (Roche Diagnostics, Vilvoorde, Belgia). În total, 0,2 până la 2 μg de ARN total au fost transcrise invers așa cum s-a descris. Primerii RTQ-PCR au fost proiectați utilizând software-ul Primer Express (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, SUA; vezi Tabelul 2). Un total de 4 până la 40 ng echivalenți de ARN total a fost amplificat folosind un iQSyber Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Nazareth, Belgia) conținând 200 nM din fiecare primer specific folosind un sistem de detectare iCycler iQ Real Time PCR (Bio-Rad Laboratories) . Pe scurt, ciclurile de prag (CT) au fost măsurate în duplicat. Valorile ACT au fost calculate pentru fiecare probă pentru fiecare genă de interes după cum urmează: gena CT de interes, -genă reporter-CT cu proteină de legare a cutiei TATA (TBP) ca genă reporter. Modificările relative ale nivelului de expresie ale unei gene specifice (ACT) au fost calculate ca ACt al grupului de test minus ACT al grupului de referință și apoi prezentate ca 2-AAT (Delaigle și colab. 26).

Tabel în dimensiune completă

Determinarea concentrației de ApN în mediu de către RIA

Concentrațiile de ApN au fost măsurate în mediu adipocitar cultivat folosind un kit RIA disponibil comercial (Linco Research, Nuclilab, Olanda). Acest kit nu face distincție între diferite forme de ApN. Probele din mediu diluat (1: 1) au fost analizate de două ori.

imunoanaliză AMPc

Concentrațiile CAMP din celule au fost măsurate folosind un kit ELISA competitiv (R&D Systems Europe Ltd., Abingdon, Marea Britanie) conform instrucțiunilor producătorului. Nivelurile CAMP au fost normalizate la nivelurile de proteine ​​celulare, determinate prin metoda Bradford.

Western blot

Adipocitele au fost omogenizate în tampon de liză (Cell Signaling Technology, BIOKÉ, Leiden, Olanda) suplimentat cu un cocktail de 1% inhibitor de protează (Roche Diagnostics). Un total de 20 μg de proteine ​​au fost dizolvate în tampon Laemmli, supuse SDS-PAGE în condiții de reducere și denaturare și apoi transferate la membranele PVDF. Următorii anticorpi au fost utilizați pentru imunodetecție: anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204), anti-phospho-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) și anti-phospho-p38MAPK (Thr180/Tyr182) Fiecare anticorp a fost utilizat conform instrucțiunilor producătorului (Cell Signaling Technology, BIOKÉ). Semnalele au fost detectate prin chemiluminescență crescută. Intensitățile benzilor au fost cuantificate prin densitometrie de scanare (Gel-Doc2000, Bio-Rad Laboratories, Ltd., Hemel Hempstead, Marea Britanie), analizate cu Quantum One (Bio-Rad Laboratories Ltd.) și normalizate la banda Actin (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgia). intensitate.

Prezentarea rezultatelor și analiza statistică

Rezultatele sunt prezentate ca valori medii ± sem pentru numărul indicat de pacienți. Compararea diferitelor condiții în cadrul aceluiași grup a fost efectuată folosind un test t Student cu două cozi (două condiții) sau o analiză repetată a varianței (mai multe condiții), urmată de testul Dunnett sau Newman-Keuls, după caz. Diferențele au fost considerate semnificative statistic la P 27, au fost, de asemenea, reglementate (aproximativ + 78%; Figura 1). Am investigat în continuare efectele Rimonabant asupra mai multor alte adipokine identificate anterior ca supraproducând OAT în obezitatea umană 18: trei chemokine (factor oncogen legat de creștere, reglat după activarea celulelor T normale exprimate și secretate, proteine ​​inflamatorii macrofage (MIP)). -1p), o interleukină (IL-7), un inhibitor al metaloproteinazei tisulare (TIMP-1) și un factor de creștere hematopoietică (trombopoietină). Expresia genei MIP-1β și IL-7 a fost reglată în jos de Rimonabant (aproximativ -26% și aproximativ -32%, respectiv; P

Expresia genică a adipokinelor în explante de OAT uman tratate cu Rimonabant. Explanatele de la indivizi obezi OAT au fost cultivate cu sau fără 10-100 nM Rimonabant (Rim) timp de 24 de ore. Nivelurile de ARNm adipokine au fost cuantificate prin RTQ-PCR, normalizate la nivelurile TBP (utilizate ca genă raportor) și sunt prezentate ca expresie relativă comparativ cu explantele de control (netratate). Rezultatele sunt medii ± sem pentru 8-12 indivizi obezi. * P 27, crescut ca în TIMP-1, în timp ce mIP-1β mARN a fost scăzut (Figura 2c).

Producția de adipokine în adipocite umane și SVC tratate cu Rimonabant. Adipocitele mature și SVC-urile izolate de indivizi obezi OAT au fost cultivate cu sau fără 100 nM Rimonabant (Rim) timp de 24 de ore. Nivelurile de ARNm adipokine ( A, c ) au fost cuantificate prin RTQ-PCR, normalizate la nivelurile TBP și prezentate ca expresie relativă comparativ cu celulele martor. Concentrația de ApN în mediu ( b ) a fost măsurată prin RIA și exprimată ca ng ml -1. Rezultatele sunt valori medii ± sem pentru 12-15 (ARNm) sau 18 (secreție de proteine) indivizi obezi. * P

Reglarea ApN prin modulație CB1R ( A ) este independent de nivelurile AMPc ( b, c ). ( A ) Modularea CB1R a expresiei genei ApN în adipocite. Adipocitele au fost cultivate cu 100 nM Rimonabant (Rim) sau 1 μM ACEA timp de 24 de ore. Nivelurile de ARNm ApN sunt prezentate ca expresie relativă comparativ cu adipocitele martor. ( b ) Inhibarea producției de AMPc pentru expresia genei ApN stimulată de rimonabant în adipocite. Adipocitele au fost cultivate cu sau fără MDL-12330A (20 μM) timp de 25 de ore, în timp ce Rim (100 nM) a fost adăugat în ultimele 24 de ore. Nivelurile de ARNm ApN sunt prezentate ca expresie relativă comparativ cu adipocitele martor. ( c ) Creșterea producției de AMPc de la Roma și prevenirea MDL. Pentru a măsura AMPc, adipocitele au fost cultivate în mediu fără ser (2% BSA) cu sau fără 100 nM Rim timp de 10 minute. Un total de 20 μM MDL-12330A a fost adăugat cu 1 oră înainte de tratamentul de margine. Nivelurile CAMP au fost măsurate prin ELISA și normalizate până la conținutul de proteine ​​adipocite. Rezultatele sunt valori medii ± sem pentru șapte ( A ), opt ( b ) și cinci ( c ) de indivizi obezi. * P 28

Astfel, am investigat dacă stimularea genei ApN cu Rimonabant a rezultat din creșterea nivelului de AMPc. Reglarea în sus a ARNm ApN de către Rimonabant nu a fost modificată utilizând inhibitorul adenilat ciclazei MDL-12330A (Figura 3b). Acest inhibitor a fost totuși eficient deoarece a împiedicat creșterea nivelurilor de AMPc cauzate de Rimonabant în adipocite (Figura 3b). Luate împreună, aceste date sugerează că AMPc nu poate fi implicat în reglementarea CE a ApN. Am blocat în continuare componentele de semnalizare a kinazei MAP cu inhibitori specifici p38MAPK (SB203580), ERK1/2 (PD98059) și JNK (SP60025). Acești inhibitori au fost testați în timpul stimulării semnalizării CB1R. Această strategie a fost aleasă deoarece fosforilarea bazală a componentelor MAPK a fost relativ scăzută și, prin urmare, părea mai ușor să detectăm o creștere (mai degrabă decât o scădere) a nivelurilor de fosforilare. Niciunul dintre inhibitorii folosiți singuri nu a modificat expresia genei ApN (nu este prezentată). Scăderea expresiei ApN de către ACEA a fost complet inversată de inhibitorul selectiv p38MAPK (P

Pe scurt, ES reglează direct echilibrul imun al OAT în obezitatea umană. În special, blocarea CB1R ameliorează starea inflamatorie atât în ​​adipocite cât și în SVC, fie prin creșterea producției de ApN și omentină, fie prin scăderea MIP-1β și IL-7. Reglementarea CE a ApN implică parțial p38MAPK.