Extracția proteinelor

Purificarea proteinei supraexprimate formează a doua etapă, și nu mai puțin importantă, a producerii proteinei recombinante pure într-un sistem de expresie heterolog. Rareori obținem proteine ​​recombinante direct dintr-un mediu lichid, extracelular (mediu de cultură), deși unele sisteme de expresie permit o astfel de secreție de proteine. Primul pas în purificarea oricărei molecule din materialul biologic este de a perturba peretele celular și membrana citoplasmatică, eliberându-l astfel în soluție.

Cunoaștem mai multe moduri de întrerupere a celulelor:

• repetat îngheț și dezgheț material - perturbarea este cauzată de formarea cristalelor de gheață (poate denatura unele proteine)
• mecanic - omogenizarea într-un mortar sau un aparat mai complex
• chimic - diferiți detergenți puternici, solvenți (pot denatura unele proteine; trebuie folosiți pentru solubilizarea proteinelor de membrană - de exemplu Triton X-100, CHAPS)
• enzimatic - acțiunea enzimelor asupra pereților celulari (de exemplu, celulaze, pectinaze, lizozimă pentru bacterii, zimolază pentru drojdie)

În cazul proteinelor, metoda „agresivă” (sau combinația de metode) depinde de localizarea lor (de exemplu, nucleul celular, citoplasma, proteina membranară, localizarea periplasmatică în cazul bacteriilor gram-negative), precum și de origine și natură a celulelor (prezența peretelui celular).) trebuie utilizat pentru:

1. a eliberat o cantitate suficientă de proteine ​​în soluție, i. faza solubilă
2. păstrează forma (conformația) și activitatea biologică a proteinei

Legătură de omogenizare

Omogenizarea este una dintre metodele mecanice de întrerupere a celulelor. După omogenizare, proteinele sunt aduse în soluție, care trebuie să aibă o anumită compoziție și pH adecvate pentru a nu-și pierde proprietățile biologice. Îl sunăm tampon (tampon), deoarece „amortizează” fluctuațiile pH-ului cauzate de diferiții compuși chimici prezenți.

Cele mai utilizate omogenizatoare sunt:

• Omogenizator olar - materialul este cel mai adesea culturi celulare de origine animală, care se omogenizează prin frecarea pistonului de un mortar de sticlă în formă de cilindru
• omogenizator cu ultrasunete, așa-numitul. sonicator - folosește unde ultrasonice pentru a perturba celulele
• presa franceza - o presiune ridicată (6000-10000 psi) este aplicată suspensiei celulei cu ajutorul unei pompe hidraulice, după care suspensia este descărcată brusc printr-un capilar îngust, celulele izbucnind din cauza decompresiei și forței de forfecare care părăsesc camera; Presa franceză este folosită în principal pentru extragerea proteinelor din celulele bacteriene
• omogenizatoare care utilizează o forță magnetică transformată în energia cinetică a perlelor pentru a perturba celulele, care perturbă suprafețele celulare prin frecare și agitare a suspensiei; sunt adesea folosite pentru a extrage proteine ​​din organe și țesuturi animale

Omogenizarea are ca rezultat o suspendare - omogeniza.

Link aditiv tampon

Utilizarea diferitelor substanțe chimice ca aditivi în soluția tampon nu este întotdeauna necesară. Acestea sunt substanțe care ajută la solubilizarea sau stabilizarea anumitor proteine. Aditivii selectați corespunzător nu ar trebui să afecteze alte proceduri de purificare sau trebuie eliminat din soluție prin dializă sau filtrare pe gel.

Legătură ultracentrifugare

Omogenatul conține diverse particule mari și grele (Resturile celulare, adică resturi celulare, organite, membrane) și material solubil (Fig., A1, B2). Prin utilizarea mai multor cicluri de centrifugare la viteze și momente diferite, putem separa într-o oarecare măsură anumite fracții cu proteinele dorite (Fig., A). Centrifugarea la viteze foarte mici (500 g/10 min) face posibilă izolarea celor mai grele nuclee celulare (Fig., A2), astfel încât să fie adecvată pentru extragerea proteinelor nucleare. Presupunând că proteina noastră recombinantă este solubilă, centrifugăm la viteze mai mari (10.000 g/20 min) pentru a îndepărta majoritatea materialului inutil, contaminant. În schimb, izolarea particulelor de membrană cu proteinele de membrană necesită ultracentrifugare (100.000 g/60 min) (Fig., A3). Centrifugarea împarte suspensia în insolubilă sediment (pelete) (în partea de jos a tubului) și supernatant (soluţie).

Cu toate acestea, uneori poate fi util centrifugare diferențială cu gradient de densitate (de exemplu, zaharoză) (Fig., B1), mai ales dacă vrem să separăm organele celulare sau corpurile mai ușoare de incluziune formate din agregate proteice recombinate de resturile celulare. În acest caz, cele mai grele resturi se așează pe fundul tubului, dar particulele mai ușoare nu pot cădea sub nivelul soluției de zaharoză mai concentrată. Rezultatul este o peletă, împărțită în fracții individuale (Fig., B3), în funcție de densitatea zaharozei. Materialul solubil va fi întotdeauna în fracțiunea superioară, deoarece este cel mai ușor.

Legătura de precipitare a proteinelor

Mai mult, proteinele trebuie deseori precipitate selectiv - precipitat dintr-o soluție eterogenă. Cea mai utilizată substanță chimică este sulfat de amoniu - (NH4) 2SO4, care provoacă așa-numitul treptat efect de sărare proteine ​​în funcție de solubilitatea lor în soluție cu putere ionică diferită. Principiul este în esență „competiția” sulfatului de amoniu cu proteina pentru moleculele de solvent (apă). Proteina precipitată formează agregate (prin interacțiuni hidrofobe) astfel încât să fie separabilă de faza solubilă centrifugare. În acest fel, este posibil, cu o concentrație crescândă de sulfat de amoniu, să se colecteze mai multe fracții care conțin proteine ​​diferite și să se analizeze aceste fracțiuni pentru prezența proteinei recombinante în cauză (de exemplu, prin SDS-PAGE).

Precipitarea proteinelor în acest mod nu provoacă denaturarea proteinelor. Sulfatul de amoniu poate fi îndepărtat din soluție prin dializă. Este o metodă rapidă și ieftină pentru îndepărtarea inițială a celor mai multe proteine ​​contaminante.

Legătură de dializă

Dializa unei soluții de proteine ​​este o metodă pentru îndepărtarea substanțelor chimice cu greutate moleculară mică din soluție care ar putea afecta negativ etapele ulterioare de purificare sau proprietățile biologice ale proteinei. Dializa are loc în pungi de dializă cu agitare constantă în tampon și la temperatură scăzută (4 ° C). Porii sacului de dializă permit trecerea doar a moleculelor mici până când se ajunge la un echilibru între compozițiile celor două soluții. Proteina rămâne închisă în sacul de dializă.

Prin dializă, unele proteine ​​pot fi renaturate până la o conformație biologic activă. Pentru ca renaturarea să fie cât mai eficientă, trebuie să aibă loc foarte încet, adesea într-o soluție foarte diluată și, astfel, într-un volum mare.

• Fotografii - scădere în greutate și rezultate - pag
• DICUNO 25 mg comprimate filmate tbl flm 30x25mg - În stoc
• Fotografii - scădere în greutate și rezultate - pag
• Fotografii - scădere în greutate și rezultate - pag
• Dezbatere - umplerea cu dulciuri și apoi practicarea Acest lucru nu ajută, spun oamenii de știință