formarea

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Rezultatul
  • Semnalizarea RA în DC controlează dezvoltarea cDC intestinală
  • RA dirijează creația in vitro subgrupuri cDC1 intestinale și cDC2
  • RA controlează transcrierile in vitro derivat cDC1 și cDC2 către modele fiziologice de exprimare a genelor.
  • RA controlează expresia factorilor de transcripție implicați în diferențierea cDC
  • Prezentarea excesivă a site-urilor de legare NF-/B/REL în promotorii de gene suprimate de gena RA
  • discuţie
  • metode
  • trepte
  • Gene Express Omnibus
  • Informatii suplimentare
  • Documente Word
  • Legende de imagine suplimentare
  • Fișiere imagine
  • Imagine suplimentară S1
  • Imagine suplimentară S2
  • Imagine suplimentară S3

obiecte

  • Semnalizare celulară
  • Celulele dendritice
  • Imunologie mucoasă
  • transcriere

abstract

Intestinele sunt expuse în mod constant la microbiotice, alimente digerate și agenți patogeni invadatori. Celulele dendritice intestinale (DC) joacă un rol cheie în homeostazia imună, direcționând răspunsurile imune adecvate fiecărui antigen și stimul prezent. DC au capacitatea unică de a preleva probe și de a procesa antigeni și de a traduce indicii microambientale pentru celulele T și B prin prezentarea de citokine și metaboliți pentru a provoca și regla răspunsurile imune sau pentru a induce sau menține toleranța.

Cele două subseturi predominante de celule dendritice convenționale (cDC) din intestinul subțire (SI) sunt identificate fenotipic ca celule CD11c + MHCII +, care sunt fie CD103 + CD11b - (cDC1), fie CD103 + CD11b + (cDC2). Subseturile variază în dezvoltare și necesită diferiți factori de transcripție. Deși ambele procese procesează antigenul local, migrează către ganglionii limfatici mezenterici (MLN), produc răspunsuri tolerogene sau stimulatoare imune și împing celulele T în intestin, ele diferă și funcțional: de ex. CDC2 exprimă TLR5, care recunoaște flagelina și sunt inductori mai buni. Celulele Th17 și sintezele IgA și cDC1 exprimă TLR3, un receptor exemplar pentru ARN-ul viral dublu catenar și prezintă Clec9A și XCR1, receptori implicați în capacitatea specializată a cDC1 de a prezenta antigeni asociați celulelor la celulele T CD8 in vivo. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 Ambele subgrupuri pot fi derivate din precursori fenotipic ai măduvei osoase (BM), 10, 11 incluzând DC pre-mucoasă (pre-μDC), un precursor intestinal care poate duce la subseturi de cDC, precum și la plasmacitoid DC. Pre-μDC exprimă receptorul de ghidare intestinal α4β7, migrează preferențial în lamina propria intestinală (LP) și repopulează eficient depozitele de cDC intestinale.

Aici, am căutat să determinăm dacă RA determină și dezvoltarea ulterioară a pre-μDC și să examinăm contribuția sa la specializarea subgrupurilor intestinale de cDC. Rezultatele noastre arată că semnalizarea RARα intracelulară reglează producția de cDC intestinal înainte de μDC și joacă un rol central atât în ​​programarea transcripțională cDC1, cât și cDC2. Arătăm în continuare că, în combinație cu factorul de stimulare a coloniei de granulocite-macrofage (GM-CSF) și Flt3L, RA direcționează producția eficientă in vitro de cDC cu caracteristicile unice ale cDC1 și cDC2 intestinale de la precursorii lor intestinali pre-μDC.

Rezultatul

Semnalizarea RA în DC controlează dezvoltarea cDC intestinală

Am evaluat inițial cDC la șoarecii cu deficit de vitamina A (VAD) hrăniți cu o dietă VAD timp de 12 săptămâni după uter. 17 VAD a afectat atât fenotipurile, cât și reprezentarea subgrupurilor de cDC intestinale. Frecvența și numărul de cDC2 (CD103 + CD11b +) au fost reduse atât la ganglionii limfatici SI LP, cât și la cei mezenterici ai șoarecilor C57BL/6, comparativ cu șoarecii din dieta de control (Figura 1a, b). Rezultate similare au fost obținute la șoareci BALB/c (imagine suplimentară Sla online) și la șoareci C57BL/6 hrăniți cu o dietă VAD începând după înțărcare (imagine suplimentară S1b). Spre deosebire de subgrupurile CD103 + cDC, populația mixtă CD103 - CD11b +, care constă din macrofage și populații mai mici de CDC3 CDC intestinale, deși diferă ca număr și frecvență în studiile noastre, nu au arătat o diferență consistentă între șoareci martor și VAD ( datele nu sunt afișate). O evaluare critică a impactului RA asupra dezvoltării macrofagelor va necesita studii cu alți markeri de macrofage.

Imagine la dimensiune completă

  • Descărcați un diapozitiv PowerPoint

RA afectează mai multe tipuri de celule din intestin, inclusiv celule stromale și epiteliu, și poate afecta indirect cDC. Pentru a determina dacă a fost semnalizare RAR intrinsecă DC, am proiectat șoareci pentru a exprima un RARα negativ dominant, RAR403, sub controlul promotorului CD11c prin încrucișarea șoarecilor CD11c-Cre cu șoareci care transportă RAR403 în aval de caseta STOP cu flanc P lox. . (dn Rara lsl/lsl). 29 Acești „șoareci DC-RAR403” au avut o reducere semnificativă a numărului absolut de cDC2 și a raportului cDC2/cDC1 în SI LP și ganglionii limfatici mezenterici în comparație cu așternuturile lor de tip sălbatic (WT) (Figura 2a), iar aceste efecte au fost mai pronunțate în șoareci care au avut două copii ale genei RAR403 (DC-RAR403 fl/fl) comparativ cu șoarecii cu o singură copie (DC-RAR403 fl/fl). Ca și în cazul șoarecilor VAD, o subpopulație de celule cDC1 intestinale la șoareci DC-RAR403 a exprimat CD207 (Langerin) (Figura 2b). Rezultatele sugerează că RA acționează intern asupra celulelor din cDC1 și cDC2 intestinale, afectând astfel fenotipul și dezvoltarea acestora. Cu toate acestea, se raportează că subseturi de macrofage intestinale prezintă recombinare cre la 30 de șoareci CD11c-cre și pot exprima RAR403 în modelul nostru; prin urmare, efectele indirecte ale macrofagelor asupra fenotipurilor cDC nu pot fi excluse.

Efectele celulelor dendritice (DC) - lipsa limitată a semnalizării acidului retinoic (RA) asupra DC (SI) a intestinului subțire. A ) Raportul dintre cDC2 și cDC1 în lamina proprie (LP) și MLN și numărul de cDC2 în SI LP din DC-RAR403 -/- (tip standard (WT)), DC-RAR403 fl/- (heterozigot) și DC - RAR403 șoareci fl/fl (homozigoti). ( b ) expresie aberantă a CD207 pe SI cDC1 de la șoareci DC-RAR403. Grafice reprezentative care ilustrează celulele de expresie CD207 folosind SI cDC1 de la șoareci DC-RAR fl/fl (celulele din poarta CD207 + sunt prezentate ca puncte mari pentru ilustrare). Graficul scatter prezintă procentul de cDC1 în SI care exprimă CD207. T-test unilateral asociat. cDC, celulă dendritică convențională; MLN, ganglioni limfatici mezenterici.

Imagine la dimensiune completă

  • Descărcați un diapozitiv PowerPoint

CDC splenic a fost, de asemenea, afectat la șoarecii DC-RAR403 (Figura suplimentară S2). Ca și în DC de șoareci DC-RAR403, un subset de splină CD8a + cDC1 la șoareci DC-RAR403, dar nu și în controalele WT, a exprimat Langerin (CD207) (Figura suplimentară S2a). Atât numerele CD11b + cât și CD8a + cDC au fost reduse la splina șoarecilor DC-RAR403, dar raportul CD11b + cDC la CD8a + cDC nu s-a modificat în comparație cu aruncătorii WT (Figura suplimentară S2b și datele nu sunt prezentate). Cu toate acestea, cDC care exprimă Clec4a4 (DCIR2, recunoscut de Mab 33D1, un marker cDC2 clasic) a fost semnificativ redus, ducând la o scădere a raportului dintre cDC2 și cDC8a + cDC1 definit de Clec4a4 (Figura suplimentară S2c). Subgrupul Clec4a4 +, care este puternic redus în număr la șoareci DC-RAR403, a exprimat, de asemenea, Esam la șoareci WT (Figura suplimentară S2d). Astfel, semnalizarea RAR intrinsecă celulară a afectat atât cDC1 și cDC2 în splină, cât și în SI.

Împreună, rezultatele sugerează că semnalizarea RAR intrinsecă DC reglează dezvoltarea și specializarea fenotipică a subseturilor de cDC atât la situsurile intestinale, cât și la cele extraintestinale, dar susține un rol deosebit de important al RA în determinarea fenotipurilor de cDC intestinale și specializarea regională în SI proximală și celule limfatice mezenterice. drenaj. noduri unde concentrațiile de RA sunt mari.

RA direcționează formarea in vitro a subgrupurilor cDC1 și cDC2 intestinale

Acidul retinoic (RA) controlează formarea subgrupurilor intenționate de celule dendractice de tip DC (DC) in vitro. ( A - c ) DC pre-mucoase (pre-μDC) au fost sortate de la șoareci BM injectați cu Flt3L și cultivați în mediu Deulbecco modificat complet de Iscove cu ser delipidat de 10% suplimentat cu Flt3L și factor de stimulare a coloniei de granulocite-macrofage (GM) -CSF fără sau cu 100 nM RA (sau AM580 in c ), cu excepția cazului în care se prevede altfel. Culturile au fost recoltate în ziua 4 și analizate prin citometrie în flux. A ) Sunt afișați markerii de suprafață și activitatea retinaldehiddehidrogenazei (RALDH) indicată de colorarea AldeFluor pe cDC1 (linie punctată) și cDC2 (linie continuă) derivată intestinală și in vitro. Reprezentantul a cel puțin trei experimente independente. ( b ) Exprimarea Clec9a pe cDC1 derivat in vitro și CD101 pe cDC2 cu concentrații variabile de RA. Reprezentantul a două experimente independente. ( c ) Este indicat raportul dintre cDC2 și cDC1, numărul de celule ale descendenței totale și numărul de cDC1 și cDC2 în culturile tratate cu concentrațiile indicate de RA sau AM580. Datele sunt reunite din trei experimente independente. cDC, o celulă dendritică convențională.

Imagine la dimensiune completă

  • Descărcați un diapozitiv PowerPoint

Cu toate acestea, adăugarea RA a dus la formarea cDC1 și cDC2 cu caracteristici fenotipice cheie ale două subseturi de cDC intestinale, inclusiv TLR3 pe cDC1 și CD101 pe cDC2, precum și expresia retinaldehiddehidrogenazei de către ambele subgrupuri (Figura 3a). Aceste rezultate sugerează că GM-CSF, Flt3L și RA lucrează împreună pentru a furniza semnalele critice necesare pentru a diferenția CDC intestinale de precursorii BM. Reglarea RA a Clec9a pentru expresia cDC1 și CD101 în subgrupul cDC2 a fost dependentă de doză (Figura 3b).

RA a provocat o creștere a cDC2 in vitro, similar cu efectul său in vivo. Când pre-μDC au fost cultivate cu diferite concentrații de RA sau agonistul RARα AM580 timp de 4 zile, prezența RA sau AM580 a crescut numărul de cDC2 generat în timp ce scădea numărul de cDC1, crescând efectiv raportul cDC2/cDC1. Efectul RA a fost dependent de doză, raportul cDC2/cDC1 crescând de la 0 la 1 nM RA și platoul crescând când concentrația RA a atins nivelul raportat pentru SI 25 (

10 nM). Deoarece numărul total de celule descendente nu a fost afectat de RA sau AM580 (Figura 3c), rezultatele sunt în concordanță cu acțiunea directă a RA asupra RARα în precursorii DC pentru a le afecta soarta.

Împreună, rezultatele sugerează un rol intrinsec celular critic al RA în specializarea cDC intestinală și definesc condițiile de cultură pentru modelarea dezvoltării cDC intestinale.

RA direcționează transcripțiile in vitro ale cDC1 și cDC2 derivate către modele fiziologice de exprimare a genelor.

Imagine la dimensiune completă

  • Descărcați un diapozitiv PowerPoint
  • Descărcați un diapozitiv PowerPoint

RA controlează expresia factorilor de transcripție implicați în diferențierea cDC

Prezentarea excesivă a site-urilor de legare NF-/B/REL în promotorii de gene suprimate de gena RA

RA activează în mod obișnuit expresia genelor, dar tratamentul RA a suprimat expresia multor gene induse sau exprimate altfel în modelul nostru de cultură. Am folosit Enrichr 38 pentru a identifica motivele de legare a factorului de transcripție supra-reprezentate în regiunile promotor ale genelor care au fost de două ori mai scăzute în celulele tratate cu RA decât în ​​celulele cDC1 de control: cele mai mari scoruri au fost factorul nuclear-kB (NF-kB) și REL TFBS ( TRANSFAC) și modulul pwm JASPAR, P ≤ 10 −20 și −12 (vezi mai jos)). Genele de reglare descendentă a RA din cDC1 au fost, de asemenea, îmbogățite semnificativ pentru genele implicate în căile de semnalizare proinflamatoare mediate de NF-κB (Wikipathways, P = 0, 00004). Motivele NF-κB au fost, de asemenea, îmbogățite pentru promotorii genelor reprimate de RA (duble sau mai multe) în diferențierea cDC2 (modulul TRANSMAC și JASPAR pwm; P 10-9). Astfel, pe lângă rolul său în creșterea producției de cDC2 în condiții in vitro care promovează diferențierea cDC1 și cDC2, RA suprimă programele genetice pro-inflamatorii.

discuţie

Am evaluat rolul semnalizării RA și RAR în generarea și programarea transcripțională a subgrupurilor specializate intestinale de cDC de la precursori tropicali intestinali in vivo, precum și într-un nou model in vitro al dezvoltării cDC1 și cDC2. Rezultatele noastre sugerează că RA acționează de fapt asupra celulelor pentru a exercita efecte globale asupra expresiei genelor în liniile cDC1 și cDC2 și dirijează programe transcripționale care controlează generarea de subgrupuri și exprimarea trăsăturilor funcționale și fenotipice care definesc specializarea intestinală a cDC1 și cDC2 in vivo. .

Combinația Flt3L, GM-CSF și RA a fost suficientă pentru a conduce dezvoltarea in vitro a pre-μDC intestinale la CD103 + cDC1 și cDC2, care au fost similare în expresia receptorului de suprafață celulară cu cele două subgrupuri găsite în peretele intestinal. Mayer și colab. 32 a arătat că Flt3L și GM-CSF împreună susțin dezvoltarea CDC3 CD103 + dependente de IRF8 și Batf3, dar am constatat că cDC1 derivat pre-μDC generat în absența RA avea un fenotip de suprafață celulară aberant și era mai puțin aliniat cu cDC1 intestinal. . în expresia genică ca cDC1 generat cu toți cei trei factori. În plus, cultura cu RA permite formarea ambelor DC intestinale de populații similare. În concordanță cu observațiile noastre la șoareci VAD, creșterea concentrațiilor de RA în măsura indicată în SI proximal (

10 nM), a crescut raportul dintre cDC2 și cDC1 în rândul descendenților pre-μDC in vitro. Concentrații mai mari au crescut și mai mult specializarea fenotipică, așa cum se indică de ex. Reglarea treptată a CD101 și Clec9a. Aceste observații susțin rolul critic al RA în dezvoltarea normală a cDC și sunt în concordanță cu rolul deosebit de important al RA în specializarea cDC în intestin și GALT, unde concentrațiile de vitamina A sunt mai mari. Modelul de cultură descris aici ar trebui să faciliteze studiile viitoare ale mecanismelor relevante.

Analizele noastre transcriptomice au confirmat că descendenții pre-μDCs cultivați cu RA s-au potrivit cu cDC1 intestinal și cDC2 in vivo în expresia genei decât omologii lor cultivați doar cu GM-CSF și Flt3L. Acest lucru a fost deosebit de evident atunci când se compară subgrupuri bazate pe expresia genelor exprimate diferențial prin cDC1 vs. cDC2 in vivo. Interesant, cDC2 derivat in vitro s-a deviat mai mult de la omologii săi in vivo decât cDC1, deși a fost generat în prezența RA, sugerând că acestea pot fi deosebit de sensibile și dependente de influențele locale de mediu. În consecință, studiile anterioare privind expresia genică a cDC-urilor din intestin, piele, țesuturi limfoide și sânge au arătat că cDC2-urile din diferite situsuri tisulare diferă mult mai mult în expresia genică decât cDC1-urile. 37

În general, descoperirile noastre sugerează un scenariu în care reglarea RA DC intestinală începe în BM, unde reglează pozitiv dezvoltarea precursorului DC precursor intestinal, pre-μDC. Pre-μDC este acasă și duce atât la cDC1, cât și la cDC2 în SI. În peretele intestinal, RA acționează direct asupra pre-μDC, probabil prin reglarea factorilor de transcripție care determină soarta, pentru a crește producția de cDC2 și pentru a controla programele de expresie genică în cDC1 și cDC2, care contribuie la specializarea lor funcțională și la capacitatea lor de a menține homeostazie imună și coordonare imună.reacții la agenții patogeni invadatori.

metode

Citometrie în flux. Probele (suspensii cu o singură celulă) au fost blocate mai întâi cu un tampon de sortare a celulelor activat fluorescent (soluție de sare echilibrată a lui Hank cu 2% ser fetal de vițel) conținând o diluție de 100 de ori a anticorpului receptor anti-șoarece FcγIII/II (BD Bioscience, San Jose, CA ). și ser de șobolan pentru a preveni legarea nespecifică a anticorpilor monoclonali. Următorii anticorpi au fost utilizați pentru colorare: CD3-PECy7/CD3-biotină (145-2C11), CD19-PECy7/CD19-biotină (ID3), NK1.1-PECy7/NK1.1-biotină (PK136), CD49b-biotină (DX-5), Ly6G-biotină (1A8), Ter-119-biotină (Ter-119), B220-PECy7/B220-biotină/B220-PerCPCy5, 5 (RA3-6B2), MHCII-AF700/MHCII-FITC (M5/114, 15, 2)/MHCII-biotină (2G9), CD11c-PB (N418), a4p7-APC/a4p7-PE (DATK32), CCR9-APC/CCR9-PE/CCR9-FITC (242503), CD103 - PE/CD103-APC (M290), CD11b-AF700 (M1/70), CD8a-PE (53-6, 7), CD45.1-PerCPCy5, 5/CD45.1-APC, CD45.2-FITC/CD45.2 -PerCPCy5,5 (RA3-6B2), CD135-PE/CD135-PerCP-efluorF710 (A2F10), CD4-AF700 (RM4-5), Sirpa-FITC/Sirpa-PerCP-eFluor710 (P84), TLR3 - PE (11F8)), Clec4a4-PE/Clec4a4-biotină (33D1), CD101-PE (Mousei101), Clec9a-PerCP-eFluor710 (44D2) și Langerin-FITC. Toate experimentele care analizează subgrupuri cDC au inclus pre-gating live, CD3e-, CD19-, NK1.1-, MHCII + și CD11c + .

Izolarea celulelor din țesuturi

Sortarea celulelor. Pre-μDC și pre-cDC au fost sortate de la șoareci tratați cu B16/Flt3L. 11 celule BM au fost izolate așa cum s-a descris mai sus și îmbogățite prin sortarea celulelor activate magnetic folosind kituri pan-DC din Miltenyi (San Diego, CA). Celulele au fost apoi sortate în Aria II sau III (BD) pentru linia (CD3, CD19) și NK1.1) -CD11c int B220 + a4β7 + CCR9 - pre-μDC și linia (CD3, CD19, NK1.1 și B220 ) - CD11c int MHCII-Sirpa + pre-cDC.

Transmisie adoptivă. Pre-μDC sortate (0, 5-1 x 106; CD45.2 sau CD45.1) au fost injectate retroorbital la destinatari (CD45.1 sau CD45.2). Animalele plăcute au fost sacrificate la 5 până la 7 zile după transmitere.

Cultura in vitro. Pre-μDC-urile au fost selectate de la BM de la șoareci tratați cu Flt3L și cultivați la 0,5 milioane de celule pe ml, 200 μl pe godeu într-o placă cu 96 de godeuri cu fund plat sau 2 ml pe godeu într-o placă cu 6 godeuri în Iscove complet modificat Mediul lui Deulbecco. (10). % ser de vițel fetal delipidat, 1 x penicilină/streptomicină) suplimentat cu 100 ng ml -1 Flt3L recombinant, 10 ng ml -1 GM-CSF recombinant și RA la concentrația indicată. Mass-media s-a schimbat în ziua 3.

A fost descrisă analiza activității aldehide dehidrogenazei

Microarray. ARN-ul total a fost izolat din cDC1 și cDC2 derivate in vitro în prezența sau absența RA 100 nM utilizând metoda de extracție a fenol-cloroformului furnizată de Immgen (//immgen.org). Integritatea ARN a fost determinată folosind un bioanalizator Agilent (Stanford PAN Facility, Stanford, CA). ARN-ul total intact din fiecare probă a fost utilizat pentru amplificare, marcare și hibridizare prin analiza expresiei. Probele au fost hibridizate cu un mouse GeneChip Gene 1.0 ST Array (Affymetrix, Santa Clara, CA). Software-ul GeneSpring GX 12.6 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) și Partek Genomic Suite (versiunea 6.6, St. Louis, MO) au fost utilizate pentru procesarea și analiza datelor microcipului.

Analize statistice. Semnificația statistică a diferențelor dintre cele două seturi de date a fost evaluată prin testul t Student, dacă nu se specifică altfel.