obiecte

abstract

Aldosteronul este un hormon mineralocorticoid produs în cortexul suprarenal. În condiții fiziologice, legarea aldosteronului la receptorii specifici intracelulari ai mineralocorticoizilor (MR) din nefronul distal reglează homeostazia electrolitului și a apei. Astfel, aldosteronul reglează volumul de sânge și tensiunea arterială. Cu toate acestea, aldosteronul contribuie, de asemenea, la dezvoltarea leziunilor renale, după cum sa raportat în mai multe studii. Aldosteronismul primar, caracterizat prin niveluri plasmatice ridicate de aldosteron și activitate scăzută a reninei, este adesea corelat cu un risc crescut de afectare renală. 5

Șoarecii Cry1,2 DKO au fost folosiți pentru a studia afectarea renală indusă de aldosteron în absența manipulării renale anterioare, a tratamentului cu sare ridicată și/sau a administrării de mineralocorticoizi. Se știe că criptocromul reglează ritmurile circadiene. 14 Șoarecii Cry1, 2 DKO prezintă o expresie crescută a ARNm și niveluri de proteine ​​ale 3β hidroxisteroid dehidrogenazei, o enzimă implicată în sinteza aldosteronului. Enzima se exprimă în principal în zona glomeruloasă, unde se știe că producția de aldosteron are loc exclusiv. Astfel, șoarecii Cry1,2 DKO prezintă niveluri ridicate de aldosteron, dar activitate plasmatică scăzută. 15

metode

Experimente pe animale

În acest studiu, am folosit șoareci criptocromi-nul (Cry1, 2 DKO), care se caracterizează prin niveluri ridicate de aldosteron plasmatic și suprimarea activității reninei. Dezvoltarea șoarecilor Cry1,2 DKO a fost descrisă mai sus. În timpul studiului, toți șoarecii au fost menținuți la o temperatură ambiantă stabilă cu un ciclu lumină-întuneric de 12 ore și au avut acces gratuit la apă și alimente. Toate protocoalele experimentale au fost efectuate pe baza experimentelor pe animale de la Universitatea Kobe, Japonia.

Am folosit șoareci Cry 1, 2 DKO și frați standard (WT) ca controale. Am împărțit șoareci masculi de 12 săptămâni în următoarele șase grupuri: șoareci WT care primesc tratament normal cu sare (WTNS; n = 17), șoareci WT care primesc tratament cu sare ridicată (WTHS; n = 16), Cry1, 2 șoareci DKO care primesc normal tratament cu sare (CRYNS; n = 13), șoareci Cry1, 2 DKO care primesc tratament cu sare ridicată (CRYHS; n = 20), șoareci Cry1, 2 DKO care primesc tratament bogat în sare și spironolactonă (CRYSPI; n = 13); ) și șoareci Cry1, 2 DKO care primesc tratament bogat în sare și hidralazină (CRYHYD; n = 6). Toți șoarecii au fost tratați corespunzător timp de 32 de săptămâni. Dieta normală cu sare a avut un conținut de NaCl de 0,2%, în timp ce dieta bogată în sare conținea 3,15% NaCl, iar apa de băut conținea 1% NaCl și 0,2% KCl. Spironolactona sau hidralazina au fost administrate în apă potabilă. Dozele de spironolactonă (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) și hidralazină (Sigma-Aldrich) au fost de 6 mg kg-1 greutate corporală pe zi și 25 mg kg-1 greutate corporală pe zi. Spironolactona este dizolvată în etanol și apoi diluată în apă potabilă.

Măsurarea tensiunii arteriale

Tensiunea arterială a fost determinată la șoareci conștienți și instruiți, utilizând un sistem neinvaziv automatizat cu manșetă de coadă (BP-98A, Softron, Tokyo, Japonia). Pentru analiza datelor a fost utilizată o valoare medie de 10 măsurători.

Analiza biochimică a sângelui și a urinei

După 32 de săptămâni de tratament, sângele a fost obținut pentru analiză biochimică prin puncție cardiacă înainte ca șoarecii să fie sacrificați. Recoltarea cu 24 de urini a fost efectuată folosind cuști metabolice cu 1 zi înainte de a ucide șoarecii. Concentrațiile serice și de creatinină în urină au fost măsurate utilizând un test enzimatic (Nescoat VLII CRE Kit; Alfresa Pharma Corp, Osaka, Japonia). Un kit de testare imunosorbent legat de enzime disponibil în comerț a fost utilizat pentru măsurarea albuminei urinare (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Aldosteronul seric a fost măsurat folosind un kit de imunoanaliză enzimatică disponibil în comerț (Enzo Life Sciences, Plymouth Meeting, PA, SUA) conform protocolului descris de producător. Serul și urina electroliți au fost măsurați utilizând un electrod selectiv de ioni și calculați utilizând ecuația Nernst.

Expresia genelor

ARN-ul total din rinichiul îndepărtat a fost extras folosind RNAIsoPlus (TaKaRa, Dalian, China). Transcrierea inversă a fost efectuată folosind ReverTra Ace (Toyobo, Osaka, Japonia) conform instrucțiunilor producătorului. Cuantificarea nivelurilor de expresie renină, MR, 11β hidroxisteroid dehidrogenază tip 2 (11BHSD2), nefrină și glucoză-6-fosfat dehidrogenază (G6PD) a fost efectuată folosind un amestec Thunderbird SYBR qPCR Mix (Toyobo, Osaka, Japonia) conform protocolului descris. producător. Primerii utilizați în acest studiu au fost după cum urmează: renină (înainte: 5'-ATGAAGGGGGTGTCTGTGGGGTC-3 '; inversă: 5'-ATGTCGGGGAGGGGGGCCCTG-3'), MR (înainte: 5'-GGAAACCAAAGGCTACCACA-3 'GGTCACAC: Tz 3 ′), 11BHSD2 (înainte: 5′-TTTGGTGCACTTGAGCTGAC-3 ′; invers: 5′-GGTATGGCATGTCTCCTGCT-3 ′), nefrină (înainte: 5′-ACTACGCCCTCTTCAAATGCA-3 ′; inversă: 5′-TCCACGG;, G; înainte: 5′-GTTAAATGGGCCAGCGAAG-3 ′; invers: 5′-CCTGCTCTGCCATGATGTTT-3 ′) și gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază (înainte: 5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3 ′ TGGA: 5′GGGGCT.

Cuantificarea histopatologiei

Evaluarea producției de specii reactive de oxigen

Evaluarea speciilor reactive de oxigen (ROS) a fost efectuată pe criozecții colorate cu dihidroetidiu. Pe scurt, criosecțiile au fost incubate cu dihidroetidiu 5 μM în dimetil sulfoxid la 37 ° C timp de 30 de minute. Cuantificarea intensității dihidroetidiului a fost efectuată utilizând 15 câmpuri vizuale la o mărire de 200x.

Analize statistice

Toate datele sunt prezentate ca medie ± sem. Am presupus că grupurile nu au fost distribuite în mod normal. Prin urmare, am efectuat o analiză statistică a mai multor grupuri folosind testul neparametric Kruskal-Wallis, urmat de testul U Mann-Whitney între cele două grupuri. Valoarea P19 a fost, de asemenea, măsurată prin expresia 11BHSD2 în întregul rinichi. Cu toate acestea, nu am observat o diferență în expresia 11BHSD2 între diferitele grupuri (Figurile 1c și d).

cronic

Concentrația serică de aldosteron ( A ) și renină ( b ), receptorul mineralocorticoid (MR) ( c ) și expresia ARNm 11pHSD2 (11BHSD2) ( d ). Nivelurile serice de aldosteron au fost măsurate la cinci până la nouă șoareci. ( b - d ) Graficele reprezintă raportul dintre expresia ARNm și expresia ARNm gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază (GAPDH) în întregul rinichi (n = 4). Datele sunt prezentate ca medie ± sem * P

Tensiunea arterială sistolică măsurată la șoareci conștienți utilizând metoda manșetei cozii. Datele sunt prezentate ca medie ± sem n = 6-14. * P

Clearance-ul creatininei ( A ), albuminurie ( b ), potasiu seric c ), sodiu seric d ), nivelul de potasiu din urină e ) și nivelurile de sodiu urinar ( f ) șoareci după 32 de săptămâni de tratament. Datele sunt prezentate ca medie ± sem n = 6-13. * P

Imagini reprezentative ale colorării periodice a acidului-Schiff (PAS) a regiunii tubulare, a colorării roșii Sirius a regiunii tubulare și a colorării GAS a regiunii glomerulare PAS ( A ). Graficele reprezintă cuantificarea scorului deteriorării tubulare ( b ), glomeruloscleroză c ) și fibroză interstițială tubulară ( d ). Afectarea tubulară a fost identificată prin colorarea PAS a zonei tubulare ca vacuolare tubulară (săgeată) și pierderea marginii periei (săgeată săgeată). Datele sunt prezentate ca medie ± sem n = 6-14. * P

Expresia nefrinei. A ) Imagine reprezentativă a colorării imunofluorescente cu nefrină și b ) cuantificarea semnalului ca procent din aria glomerulară (n = 5-10). ( c ) Graficele reprezintă raportul dintre expresia ARNm și expresia ARNm GAPDH (n = 5-7). Datele sunt prezentate ca medie ± sem * P

Colorare cu dihidroetidiu (DHE) ( A ), cuantificarea colorării DHE b ) și expresia mARN a glucozei-6-fosfat dehidrogenazei (G6PD) ( c ). Cuantificarea colorării DHE a fost efectuată pe cinci probe din fiecare grup. ( A ) Colorarea DHE pozitivă prezintă colorarea fluorescentă roșie pe nucleul celulei în regiunile glomerulare (G) și tubulare (T). ( b ) Cuantificarea intensității colorării DHE. ( c ) Graficele reprezintă raportul dintre expresia ARNm G6PD și expresia ARNm GAPDH (n = 6-11). Datele sunt prezentate ca medie ± sem * P 20, 21, 22 Prin urmare, hipertensiunea nu trebuie utilizată ca o condiție prealabilă pentru diagnosticul primar de aldosteronism. De asemenea, se sugerează că normokaliemia nu ar trebui să excludă posibilitatea hiperaldosteronismului primar. 23

Am observat că șoarecii Cry1, 2 DKO din acest studiu au dezvoltat albuminurie după tratamentul normal cu sare și în absența tensiunii arteriale crescute. Aldosteronul își exercită efectul prin legarea la MR. MR se exprimă în rinichi în principal în tubii distali și în conductele colectoare. Expresia MR mai scăzută a fost raportată în glomeruli, în special în celulele mezangiale 25 și podocite, 26 în care aldosteronul poate acționa direct. La șobolanii nefrectomizați unilaterali cărora li s-a administrat aldosteron și tratament cu sare ridicată, proteinuria sa asociat cu scăderea nivelului de nefrină, o proteină asociată podocitelor. 26 Nefrina este exprimată în mod specific în membrana membranară a podocitelor și, prin urmare, joacă un rol important în funcția barierei de filtrare glomerulară. În acest studiu, am observat că șoarecii Cry1, 2 DKO au prezentat niveluri reduse de expresie a nefrinei. Prin urmare, propunem că o reducere a expresiei nefrinei la șoarecii Cry1,2 DKO are ca rezultat întreruperea barierei de filtrare glomerulară și astfel afectează cel puțin parțial nivelurile de albumină urinară.

În comparație cu modelele animale care combină nefrectomia unilaterală cu expuneri ridicate la sare și mineralocorticoizi, unde tratamentul relativ pe termen scurt (4-8 săptămâni) a cauzat leziuni renale severe, inclusiv glomeruloscleroza și fibroza renală, 8, 12 leziuni renale observate în sarea normală. șoarecii Cry1, 2 DKO tratați timp de 32 de săptămâni au fost mai puțin severe. În plus, chiar și după 32 de săptămâni de tratament cu sare ridicată, șoarecii Cry1, 2 DKO nu au dezvoltat glomeruloscleroză sau fibroză interstițială. Pe baza acestor observații, nu putem exclude faptul că hiperaldosteronismul cronic endogen poate induce mecanisme adaptative care ar putea limita efectele dăunătoare ale aldosteronului. Aceste rezultate pot reflecta constatările clinice la pacienții cu aldosteronism primar, care au adesea microalbuminurie și o rată crescută de filtrare glomerulară 31, care poate fi tratată cu succes fie cu terapie adrenalectomică, fie cu blocant MR. 32, 33, 34 În plus, se crede că leziunile renale severe se dezvoltă după câțiva ani. 35

Având în vedere rolul criptocromilor în ritmurile circadiene, efectul ștergerii criptocromului la șoarecii Cry1,2 DKO nu poate fi ignorat. Creșterea nivelului de albumină urinară, scăderea expresiei nefrinei și creșterea producției de ROS la șoarecii CRYHS tratați cu sare au fost inhibate de tratamentul cu spironolactonă. Astfel, am emis ipoteza că leziunile renale la șoarecii Cry1, 2 DKO au fost asociate cu hiperaldosteronism.

În cele din urmă, nivelurile de expresie a nefrinei și producția de ROS la șoareci din grupul tratat cu spironolactonă au fost mai bune decât în ​​grupul CRYNS și comparabile cu cele din grupul WTNS. În plus față de inhibarea efectului combinat al hiperaldosteronismului și sării, spironolactona poate, de asemenea, să suprime efectul hiperaldosteronismului singur.

În concluzie, studiul nostru a arătat că efectele nocive ale aldosteronului asupra rinichilor pot fi independente de expunerea la săruri ridicate și tensiune arterială crescută, dar tratamentul cu un conținut ridicat de sare agravează aceste efecte. Pe baza constatărilor noastre, sugerăm că controlul tensiunii arteriale ar putea să nu fie suficient pentru a proteja rinichii în aldosteronismul primar; în astfel de cazuri, totuși, blocarea suficientă a aldosteronului poate fi suficientă pentru a proteja rinichii.