obiecte

abstract

În mod caracteristic, celulele cancerului de prostată (PCa) prezintă o scădere marcată a zincului intracelular; Cu toate acestea, mecanismul responsabil nu este clar înțeles. HOXB13 este implicat în progresia PCa și este supraexprimat în PCa rezistentă la castrare. Analiza ADN a microarraysurilor de celule LNCaP Pca a arătat că transportorii de ieșire de zinc ZnT au fost în mod vizibil reglementați în sus printre genele țintă HOXB13 independente de androgen. În plus, HOXB13 exogen a provocat o scădere a concentrațiilor intracelulare de zinc în celulele PCa, a stimulat semnalizarea mediată de NF-κB prin reducerea inhibitorului alfa NF-κB (IκBα) și a îmbunătățit translocația nucleară RelA/p65. Tumorile de prostată umană au arătat, de asemenea, o puternică corelație inversă între expresiile de proteine ​​HOXB13 și IκBa. În consecință, HOXB13 a stimulat invazia celulelor PCa, care a fost inhibată de suprimarea ZnT4. În plus, studiile efectuate pe un model de șoarece ortotopic PC3 cu metastaze PCa au arătat că HOXB13 este un stimulator metastatic puternic. Luate împreună, aceste rezultate indică faptul că HOXB13 promovează invazia și metastaza PCa prin reducerea nivelurilor de zinc intracelular, stimulând astfel semnalele NF-κB și sugerează că HOXB13 acționează ca un modulator al nivelurilor de zinc intracelular care promovează proprietățile maligne ale PCa.

În acest studiu, am examinat rolul HOXB13 în reglarea mediată de zinc a semnalizării NF-κB pentru a ne îmbunătăți înțelegerea implicării HOXB13 în progresia PCa către CRPC. Prostata umană normală acumulează niveluri mai ridicate de zinc decât orice alte țesuturi moi și, prin urmare, zincul este considerat o componentă esențială a unei prostate sănătoase. Cu toate acestea, nivelurile de zinc sunt mult reduse în tumorile epiteliale de prostată și continuă să scadă în timpul progresiei către o creștere independentă de androgen. În acest studiu, am efectuat analize complementare de microarray de ADN în celule LNCaP crescute în condiții de androgen sărăcit pentru a profila gene independente de androgen care vizează HOXB13. Una dintre aceste gene țintă, purtătorul de ieșire a zincului ZnT4, a fost analizată în detaliu pentru a identifica orice asociere între HOXB13 și cascadele de biomolecule mediate de zinc. Acest studiu a fost efectuat pentru a determina modul în care celulele prostatei se adaptează la supraviețuire prin tumorigeneză și progresie către celulele CRPC.

Rezultatul

ZnT4 (transportor de ieșire din zinc) este ținta HOXB13

intracelular

ZnT4, un transportor de ieșire din zinc, este ținta HOXB13. ( A ) Analiza ierarhică în cluster a genelor exprimate diferențial în celulele LNCaP în condiții de epuizare hormonală. Pentru a examina genele țintă HOXB13, analiza microarray-ului ADN a fost efectuată într-o stare fiziologică în care HOXB13 (B1-B3) a fost minim supraexprimat în LNCaP comparativ cu martorii (G1G3). Această imagine prezintă transcrieri reglementate în sus și în jos, în roșu și verde. Această revizuire a nivelurilor relative de expresie a genelor reglate HOXB13 arată gene țintă a căror expresie s-a modificat de cel puțin două ori abundențele medii din control. ( b ) Exprimarea mARN-ului transportorului de zinc în celulele LNCaP (panoul superior). Expresia HOXB13 a fost controlată de adenovirus. Expresia genei afișate este un mijloc de trei analize RT-PCR independente în timp real și este prezentată ca medie ± sd (panoul inferior). ( c ) Exprimarea proteinei ZnT4 folosind Western blot. Celulele HEK293 au fost transfectate cu Homoamine șterse din pFLAG-HOXB13, pFLAG sau pFLAG-HOXB13.

Imagine la dimensiune completă

HOXB13 a redus nivelurile intracelulare de zinc și a stimulat semnalizarea NF-κB în celulele PCa

HOXB13 reduce nivelurile intracelulare de zinc și stimulează semnalizarea NF-κB în celulele PCa. Celulele LNCaP-S4 au fost crescute în condiții de epuizare a androgenilor timp de 3 zile și astfel forțate să exprime HOXB13. LNCaP-shHOXB13 sunt celule suprimate HOXB13. Celulele PC3 au fost transfectate cu Flag-HOXB13. Celule LNCaP-S4 ( A ) sau celule de control Tet-on ( b ) au fost tratați cu Dox pentru a induce HOXB13. De asemenea, au fost utilizate celule suprimate HOXB13 (1-3, 4-1) și comparate cu celulele mixte ( c ). Celulele au fost analizate pentru conținutul de zinc intracelular. După cultivarea celulelor PC3 ( d ) sau celule LNCaP-S4 ( e ) S-a adăugat TNF-a peste 24 de ore pentru a stimula activitatea NF-κB. Celule LNCaP-S4 ( f ) sau shHOXB13-LNCaP ( g ) au fost preincubate cu zinc și/sau piritionă timp de 30 de minute și apoi incubate cu TNF-a timp de 2 ore. Celulele au fost evaluate prin teste de luciferază. *** în diagramă indică diferențe semnificative între cele două grupuri, așa cum sunt determinate de testul t al Studentului cu două cozi (P

Activarea NF-κB de către HOXB13 este mediată de IκB. ( A ) Expresia HOXB13 a fost indusă în celulele LNCaP-S4 cu Dox și lizații corespunzători au fost colectați și Western Blot (panoul din stânga, lizatele întregi; panoul din dreapta, extracte nucleare). ( b ) Celulele suprimate cu HOXB13 (1-3 și 4-1) și celulele de control mixte au fost evaluate pentru expresia proteinei pNF-κB (panoul stâng, lizat întreg, panoul drept, extracte nucleare).

Imagine la dimensiune completă

Expresia HOXB13 a fost corelată indirect cu expresia IκBα în tumorile de prostată

Deoarece HOXB13 a reglementat activitatea NF-κB prin reducerea activității IκBα în celulele PCa, am evaluat expresia țesutului HOXB13 și IκBα în 9 CRPC și 12 PCaze androgen-dependente (ADPC). Cu toate acestea, din moment ce PCa a fost eterogenă, am evaluat numai celulele PCa cu efect pozitiv asupra receptorului de androgen (AR). Figura 5A arată expresia HOXB13 și IκBα și că tumorile care supraexprimă HOXB13 nu au exprimat IκBα (a-d). Acesta a fost în special cazul CRPC-urilor, deoarece numai CRPC-urile care au supraexprimat HOXB13 nu au exprimat IκBα. Mai multe ADPC-uri care supraexprimă HOXB13 au exprimat IκBα (e-h), în timp ce unele celule tumorale și celule din hiperplazie benignă de prostată au prezentat o expresie scăzută a HOXB13 și IκBα mare (i-1). Când termenii înalți și cei mici au fost atribuiți în mod arbitrar un scor de 2-3 sau 0-1, termenii HOXB13 și IκBα au fost invers corelați (χ 2 = 4, 888, P

Expresia HOXB13 se corelează indirect cu IκBα în tumorile de prostată. ( A ) Imunomarcarea a fost efectuată în diferite țesuturi ale prostatei folosind secțiuni seriale. RA a fost folosit ca control intern. Scara este de 100 μm. Inserțiile au fost afișate ca mărire x 40. ( B ) Grafic cu bare care prezintă scorurile HOXB13 ale PCAS supraexprimate și -exprimate HOXB13. Expresiile HOXB13 și IκBa în tumori au fost evaluate (0, absent, 1, slab, 2, moderat și 3 puternic). Asteriscurile indică P

HOXB13 crește potențialul invaziv al celulelor PCa. ( A ) Invazia celulară a fost măsurată folosind transwell matrigel. Celulele suprimate HOXB13 (1-3 și 4-1) și celulele mixte au fost crescute în condiții de androgen epuizat timp de 2 zile. Mediul care conține fibronectină a fost adăugat în camerele inferioare. După 24 de ore, celulele au fost colorate și imaginile au fost capturate. ( b ) Celulele au fost numărate în cinci câmpuri selectate aleatoriu la mărire x 200; rezultatele sunt prezentate sub forma unui grafic cu bare. ( c Celulele HOXB13 S4 induse de Dox au fost placate și apoi transfectate cu si-ZnT4 (50 nM) sau si-control și celulele transfectate au fost aplicate testelor de invazie așa cum s-a descris mai sus. Testele au fost efectuate în trei exemplare; coloanele reprezintă media ± sd ( d ) celulele shHOXB13-LNCaP au fost crescute în condiții de epuizare a androgenilor timp de 2 zile. Celulele au fost apoi extrase și lizatele au fost evaluate prin Western blot. ( e ) Mediul condiționat din celule LNCaP-shHOXB13 (panoul din stânga) sau celulele LNCaP-S4 (panoul din dreapta) a fost supus testului de zimografie pe gelatină. Sunt prezentate formele de MMP-9 și MMP-2.

Imagine la dimensiune completă

HOXB13 a stimulat metastazele ganglionare din celulele PCa

Metastaze ale tumorilor PC3-HOXB13 la ganglioni limfatici para-aortici. ( A ) Celulele PC3 transfectate stabil au fost imunoblotate pentru FLAG. ( B ) Ganglionii limfatici paraortici au fost împărțiți pentru a detecta metastazele și s-au numărat numărul de metastaze. Frecvența metastazelor la ganglionii limfatici ai șoarecilor a fost de 75,0% (șase din opt șoareci purtători de tumori) în grupul PC3-HOXB13 și de 14,3% (unul din șapte șoareci purtători de tumori) în grupul PC3-simulat. ( C ) Sunt prezentate tumorile PC3-HOXB13 locale (a - c) și metastatice (d - f) selectate. Câmpurile din „a” și „d” sunt mărite în „b” și „e”. Secțiunile seriale „b” și „e” au fost imunomarcate pentru FLAG (c, f).

Imagine la dimensiune completă

discuţie

Rezultatele noastre sugerează că HOXB13 stimulează în cele din urmă proprietățile invazive ale celulelor PCa prin reducerea nivelului de zinc intracelular, în special în condiții de androgen. Propunem un model ipotetic pentru mecanismul de acțiune al HOXB13 în timpul invaziei PCa (Figura 8): (1) HOXB13 reglează în sus canalele de eflux de zinc, inclusiv ZnT4, în condiții de androgen epuizat. (2) ZnT4 facilitează scurgerea de zinc din celule. (3) Nivelurile scăzute de zinc intracelular stimulează expresia IKKα, care fosforilează și degradează în continuare IκBα. (4) NF-κB stimulator eliberat, cum ar fi p65 și p50, se translocează în nucleu și activează expresia genelor implicate în invazia și metastaza celulelor tumorale.

Model hipotetic al invaziei PCa mediată de HOXB13. Atunci când HOXB13 este supraexprimat în cancerele de prostată rezistente la ablație, sugerăm că HOXB13 funcționează pentru a promova invazia celulelor canceroase după cum urmează: (1) HOXB13 reglează în sus canalele de eflux de zinc, inclusiv Znt4, în condiții de androgen epuizat. (2) ZnT4 facilitează efluxul de zinc intracelular. (3) Scăderea nivelului de zinc intracelular stimulează expresia IKKα, care fosforilează și degradează IκBα. (4) NF-κB stimulator eliberat, inclusiv p65 și p50, se translocează în nucleu și activează expresia genelor implicate în invazia celulelor tumorale.