abstract

În timp ce terapiile actuale pot fi eficiente inițial, multe tumori devin în cele din urmă chimiorezistente, ducând la eșecul tratamentului. Ca urmare, rămâne o nevoie urgentă de noi abordări terapeutice pentru tratamentul cancerului ovarian.

Imagistica și terapia bolii tiroidiene sunt posibile datorită capacității glandei tiroide de a acumula iodură. Aceasta este mediată de simbolul iodurii de sodiu (NIS), o glicoproteină transmembranară exprimată pe membrana basolaterală a celulelor foliculare tiroidiene. Evoluțiile recente în terapia genică au condus la numeroase studii care au ca scop introducerea expresiei NIS în alte tipuri de tumori pentru a furniza imagini și terapie cu iod radioactiv. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 Capacitatea de a introduce expresia NIS în tumorile ovariene ar fi foarte benefică. Împreună cu istoricul dovedit pe scară largă în terapia radioiodă tiroidiană, NIS oferă un avantaj major ca genă terapeutică, deoarece oferă imagistică pentru a confirma expresia țintă a proteinelor înainte de a continua terapia. De asemenea, efectul secundar asociat cu utilizarea 131 I înseamnă că nu toate celulele țintă trebuie să exprime NIS pentru a obține un efect terapeutic complet. 12

În trecut, am descris utilizarea cu succes a promotorului MUC1 pentru a conduce expresia NIS pentru imagistica radioiodică și terapia celulelor cancerului de sân. Supraexpresia MUC1 a fost raportată, de asemenea, în majoritatea tumorilor ovariene, 18, 19, 20, 21 și, prin urmare, acest construct are potențial de aplicare în acest model tumoral. Acest studiu descrie introducerea expresiei NIS în celulele tumorale ovariene atât in vitro cât și in vivo, urmată de imagistica 123 I și terapia 131 I.

Tumorile ovariene prezintă o altă provocare pentru terapia genică mediată de virus, deoarece s-a demonstrat că exprimă niveluri variabile de molecule necesare pentru infecția cu adenovirus, cum ar fi receptorul coxsackievirus și receptorul adenovirusului (CAR) și integrinele. Prin urmare, două construcții de adenovirus care conțin NIS sub controlul (1) citomegalovirusului (CMV) sau (2) promotorilor MUC1 au fost utilizate pentru a infecta linia celulară a cancerului ovarian (OVCAR-3), despre care s-a raportat că exprimă niveluri moderate de CAR. Promotorul puternic nespecific CMV a fost utilizat inițial pentru a determina dacă expresia funcțională NIS ar putea fi determinată în acest model in vivo. După tratamentul cu succes al tumorilor transduse de CMV/NIS, constructul MUC1/NIS a fost utilizat pentru a furniza direcționarea transcripțională a tumorilor pozitive MUC1 și pentru a reduce în continuare riscul de toxicitate extratumorală. Acest studiu reprezintă un prim pas promițător care explorează potențialul pentru imagistica radioiodină mediată de NIS și tratamentul tumorilor ovariene.

Rezultatul

125 I studii de absorbție

Capacitatea celulelor OVCAR-3 de a absorbi iodura în diferite momente de timp după infecția cu Ad/CMV/NIS sau Ad/MUC1/NIS a fost examinată in vitro (Figura 1). Absorbția optimă a iodurii a fost observată la 3 zile după infecție, cu o creștere de 12 ori peste celulele transduse CMV/NIS (4226 ± 169 cpm) față de celulele de control comparativ cu o creștere de 5,5 ori a celulelor transduse MUC1/NIS (1898). . ± 23 cpm). În toate cazurile, absorbția de iod a fost blocată în prezența KCLO4, un inhibitor cunoscut al funcției NIS.

imagistica

Captarea de iod în celulele OVCAR-3 în diferite momente de timp după infecția cu adenovirus care conține NIS sub controlul promotorilor CMV sau MUC1 (multiplicitatea infecției (MOI) 80). Absorbția optimă de iodură cu ambele constructe a fost observată la 3 zile după infecția virală. Absorbția de iod a fost blocată în prezența KClO4, un inhibitor cunoscut al funcției NIS.

Imagine la dimensiune completă

Western blot

Extractele de proteine ​​de membrană (10 μg) din celulele carcinomului ovarian transduse de NIS (OVCAR-3) au fost supuse Western blot cu un anticorp monoclonal de șoarece împotriva aminoacizilor 468 până la 643 de proteină NIS umană (Figura 2). Extractele de membrană din celule infectate cu CMV/NIS (Figura 2a (ii)) și MUC1/NIS (Figura 2b (ii)) au fost pozitive pentru proteina NIS la dimensiunea preconizată de -75-100 kDa. Mărimea proteinei NIS depinde de starea de glicozilare și poate varia de la 50 la 110 kDa, 50 kDa reprezentând proteina neglicozilată. Nivelul de imunoreactivitate detectat în celulele transduse de CMV/NIS a fost mai puternic decât nivelul observat atunci când NIS se afla sub controlul promotorului MUC1, chiar dacă această linie celulară exprimă niveluri ridicate de proteină MUC1. Nu s-a detectat proteină NIS în celulele infectate cu virusul de control (Figura 2a (i) și b (i)), deși au fost observate unele benzi slabe nespecifice.

Analiza Western blot a expresiei NIS în celulele OVCAR-3 după infecție. ( A ) (i) Ad5/NIS, (ii) Ad5/CMV/NIS. ( b ) (i) Ad5/NIS, (ii) Ad5/MUC1/NIS. Extractele de membrană din celulele OVCAR-3 infectate cu Ad5/CMV/NIS ( A (ii)) și Ad5/MUC1/NIS ( b (ii)) a prezentat o imunoreactivitate puternică împotriva anticorpului anti-NIS de șoarece, dezvăluind o proteină ∼ 75-100 kDa. În ambele cazuri, expresia NIS nu a fost detectată în extracte de membrană din celule transfectate cu virusul de control ( A (i), b (i)).

Imagine la dimensiune completă

imunohistochimie

Celulele OVCAR-3 transduse de NIS au fost fixate în metanol și supuse colorării imunohistochimice pentru a determina locația proteinei NIS în celulă (Figura 3). Celulele infectate cu NIS sub controlul promotorilor CMV (Figura 3b) sau MUC1 (Figura 3c) au fost, de asemenea, pozitive pentru proteina NIS citoplasmatică cu membrană. Pentru ca proteina NIS să funcționeze, trebuie să fie direcționată către membrana celulară. Când se află sub controlul promotorului CMV, NIS pare să fi îmbunătățit direcționarea către membrană, care s-a corelat cu nivelurile crescute de absorbție a iodurii observate în Figura 1. Celulele infectate cu virus fără promotor au fost negative pentru imunoreactivitatea NIS (Figura 3a).

Analiza imunohistochimică a expresiei NIS în celulele OVCAR-3 după infecție ( A ) controlul virusului, ( b ) Ad5-CMV-NIS sau ( c ) Ad5-MUC1-NIS. În celulele transduse de NIS, a fost detectată imunoreactivitatea atât la membrană, cât și la imunoreactivitatea citoplasmatică NIS. Celule infectate cu viruși fără promotor ( A ) au fost negative pentru imunoreactivitatea INS.

Imagine la dimensiune completă

Imagistica in vivo 123 I

Imagistica in vivo a tumorilor OVCAR-3 a trei șoareci utilizând o cameră gamma după administrarea de 0,5 mCi 123 I. Cu 3 zile înainte de administrarea iodurii, șoarecilor li s-au administrat injecții intratumorale de Ad/CMV/NIS, Ad/MUC1/NIS sau virus de control. Toate cele trei imagini prezintă absorbția iodurii în tiroidă și stomac, care exprimă NIS, precum și în vezică, unde iodura este excretată în urină. O poză ( A ) arată, de asemenea, o imagine clară a unei tumori care a fost infectată cu Ad/CMV/NIS pe flancul stâng cu o imagine mai puțin intensă a tumorii evidente la un animal injectat cu constructul MUC1/NIS ( b ). În panou ( c ), în cazul în care tumora din stânga a fost infectată cu un virus de control, nu există nicio imagine tumorală.

Imagine la dimensiune completă

131 I terapie

Șoarecii au primit o injecție intratumorală de 5 x 108 PFU Ad/CMV/NIS, Ad/MUC1/NIS sau Ad/CMV, 3 zile mai târziu o doză intraperitoneală de 3mCi 131I sau soluție salină. Dimensiunea tumorii (L × W × H × 0,51) a fost apoi măsurată săptămânal folosind etriere (Figura 5).

Terapia in vivo cu iod radioactiv a xenografelor tumorilor ovariene OVCAR-3. Tumorile au fost infectate cu Ad5/CMV/NIS, Ad5/MUC1/NIS sau cu virusul de control (linie punctată) urmate de o doză intraperitoneală de 131 L sau soluție salină. Analiza statistică a fost efectuată folosind testul t Student, cu P = 0,05 considerat statistic semnificativ. Ad5/CMV/NIS + 131 I versus Ad/CMV/NIS– 131 I, P 131 I în comparație cu Ad5/CMV (fără NIS) + 131 I, P 131 I, reduse treptat în dimensiune la 131 I, au crescut dramatic până la medie volum 268 ± 35 și 332 ± 154% din volumul inițial (P 15, 28 este primul studiu care a raportat terapia 131 I mediată de NIS a tumorilor ovariene la un model animal.

Deși aceste rezultate preliminare sunt oarecum promițătoare pentru utilizarea terapiei mediată de NIS pentru tumorile ovariene, lipsa de specificitate oferită de promotorul CMV poate fi problematică. Cele mai multe tipuri de cancer ovarian nu sunt depistate decât după metastază și constau astfel din mai multe tumori diseminate, adesea limitate la cavitatea peritoneală. Prin urmare, administrarea intraperitoneală a virusului este o cale atractivă pentru tratamentul acestei boli, în scopul creșterii interacțiunii virus/celulă tumorală, care, totuși, ridică îngrijorări cu privire la selectivitate. Imagistica radioinidă neinvazivă poate fi efectuată pentru a confirma localizarea corectă a INS înainte de a continua terapia. Cu toate acestea, direcționarea transcripțională a expresiei NIS ar putea crește doza de virus către celulele țintă și să evite toxicitatea ficatului și a celulelor mezoteliale normale.

Recent am descris regresia tumorală completă după tratamentul xenogrefelor de cancer de sân Ad5/MUC1/NIS la șoareci. Marea majoritate a tumorilor ovariene este, de asemenea, raportată la supraexprimarea MUC1, 18, 19, 20, 21, în timp ce celulele mezoteliale normale sunt slab sau nu sunt deloc exprimate. 29 În urma succesului construcției CMV/NIS, am folosit Ad/MUC1/NIS pentru a furniza direcționarea transcripțională a tumorilor și a minimiza efectele potențiale asupra celulelor normale înconjurătoare. În prezentul model, în ciuda faptului că celulele OVCAR-3 exprimă proteina robustă MUC1, cele 18 niveluri ale expresiei NIS nu au fost suficient de ridicate pentru a induce regresia tumorii după terapia 131 I. Acest lucru se poate datora eficienței reduse a infecției comparativ cu sânul modelul cancerului. Imagistica 123I a arătat o absorbție limitată de iodură la locul tumorii. Cu toate acestea, la momentul săptămânii de 8 săptămâni, volumul tumorii a fost semnificativ mai mic după infecția MUC1/NIS și terapia 131 I comparativ cu tumorile de control. Acest lucru sugerează că, odată cu îmbunătățirile care duc la niveluri mai ridicate de expresie, aceasta poate fi o abordare viabilă pentru acest model de tumoră.

Succesul transferului de gene mediat de adenovirus depinde de o transducție eficientă in vivo. Includerea unui element amplificator în amonte de promotorul MUC1 poate crește nivelul de expresie NIS obținut, dar nu depășește ratele de transducție tumorală suboptimă. Multe grupuri au demonstrat o infecție îmbunătățită a modelelor ovariene de ovare care epuizează CAR utilizând constructe de adenovirus independente de CAR sau tropism pentru a ocoli ficatul și a viza tipuri de celule specifice care sunt în mod normal refractare la infecția cu adenovirus. 32, 33, 34, 35. Acest lucru ar putea crește încărcătura virală la locul tumorii și ar permite utilizarea unor doze virale mai mici, reducând potențial răspunsul imun după administrarea virusului.

Rezultatele preliminare promițătoare prezentate aici arată imagistica radioiodică și terapia tumorilor ovariene în combinație cu formarea vectorilor adenovirali modificați, sugerând potențialul terapiei mediată de NIS ca o nouă abordare a tratamentului cancerului ovarian.

Materiale și metode

Cultură de celule

Linia celulară de carcinom ovarian OVCAR-3 a fost menținută în mediu RPMI suplimentat cu 10% ser fetal bovin și penicilină G (2 U/ml)/sulfat de streptomicină (100 mg/ml). Celulele au fost menținute la 37 ° C, 5% CO 2 cu mediu a fost schimbat de două ori pe săptămână și trecerea la fiecare 7 zile.

Producția de adenovirus

O construcție de serotip 5 de adenovirus recombinant uman cu deficiență de replicare care conține NIS uman sub controlul promotorului MUC1 (-1401 până la +33) a fost pregătită în colaborare cu ViraQuest Inc. (North Liberty, IA, SUA), așa cum este descris mai sus. Pe scurt, insertul MUC1/NIS a fost donat într-un vector plasmidic VQ/5k furnizat de ViraQuest și apoi transfectat în 293 celule care conțin ADN adenoviral restricționat anterior la îndepărtarea unei porțiuni din regiunea E1. După purificarea plăcii, adenovirusul Ad/MUC1/NIS recombinant a fost extins în 293 celule și purificat prin bandare pe gradienți de densitate CsCl, urmată de dializă. Un alt adenovirus deficient de replicare care conține NIS sub controlul promotorului CMV nespecific a fost în stoc din experimentele anterioare și a fost generat utilizând aceeași tehnică. 16

Infecția cu adenovirus a celulelor OVCAR-3

Celulele au fost placate în plăci cu 12 godeuri cu o zi înainte de infecție la o densitate de însămânțare de 1,5 x 105 celule/godeu pentru a atinge confluența de ± 60% pentru infecție. Celulele au fost apoi spălate și incubate în mediu fără ser și s-au adăugat diferite cantități de virus în fiecare godeu. După 3 ore de incubare la 37 ° C, celulele au fost spălate și incubate în mediu complet timp de 72 de ore înainte de analiza funcției/expresiei NIS. Toate infecțiile cu adenovirus au apărut cel puțin în trei exemplare.

125 I studii de absorbție

Capacitatea celulelor de a concentra iodura a fost determinată așa cum este descris în Weiss și colab. Pe scurt, după transfecție, celulele au fost incubate în HBSS conținând 10 mM HEPES, 10 μM NaI și 0,1 μCi Na125I/ml, pH 7, 3 și 10 μM KClO 4, un inhibitor competitiv de captare a iodurii de NIS, a fost inclus în godeurile de control. După o incubare de 45 de minute la 37 ° C, celulele au fost spălate cu soluție salină tamponată cu fosfat rece ca gheața, lizate cu NaOH 1 M și iodura concentrată a fost măsurată pe un colector γ.

Extracția membranei

Proteinele de membrană au fost extrase din celulele infectate folosind procedura descrisă mai sus. Pe scurt, celulele au fost spălate și resuspendate în tampon A (250 mM zaharoză, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM EDTA, 10 μg/ml leupeptină, 2 μg/ml aprotinină, 1 mM PMSF). și apoi înghețat peste noapte la -20 ° C. Suspensia celulară a fost apoi dezghețată și centrifugată la 500 g timp de 15 minute la 4 ° C. S-au adăugat 1 ml Na 2 CO 3 1 ml per ml de supernatant, urmat de agitare la 4 ° C timp de 45 minute. A fost apoi centrifugat la 100.000 g timp de 15 minute și peleta a fost resuspendată în tampon B (250 mM zaharoză, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM MgCl2). Conținutul de proteine ​​a fost determinat folosind BioRad DC Protein Assay (Hercules, CA, SUA).

Analiza Western blot

Pentru analiza Western blot a fost utilizat un sistem de electroforeză NuPAGE (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA). Proteina de membrană din liniile celulare (10 μg) a fost redusă în DTT (0,5 M) timp de 10 minute la 70 ° C. Probele au fost apoi prelevate pe un gel de poliacrilamidă prefabricată cu gradient NuPAGE Bis-Tris 4-12% timp de 1 oră la 200 V. Alicote de standarde de greutate moleculară proteică au fost efectuate simultan pe fiecare gel pentru a compara dimensiunea probei. Electroblotarea a fost efectuată timp de 1 oră la 25 V pentru a transfera probe de proteine ​​la o membrană de nitroceluloză. Pentru a preveni legarea nespecifică, membranele au fost incubate în lapte 5% în TBS-T (20 mM Tris, 137 mM NaCI, 0,1% Tween 20) timp de 1 oră, urmată de spălare în TBS-T. Membranele au fost incubate în anticorp monoclonal de șoarece (1: 20.000 în lapte 0,1%) îndreptat împotriva proteinei umane NIS (aa 468-643) 38 timp de 1,5 ore și spălate în TBS-T. Apoi, anticorpul anti-șoarece de capră marcat cu peroxidază de hrean (1: 10.000) a fost adăugat la membrane timp de 1,5 ore. După etapele de spălare, reactivii ECL Western Blotting Detection (Amersham, Arlington Heights, IL, SUA) au fost aplicați pe membrane timp de 1 minut. Filmele Kodak BIOMAX MR au fost apoi expuse membranelor timp de aproximativ 2 minute.

Analiza imunohistochimică

Celulele au fost plasate în lamele cu două camere la o densitate de inoculare de 1,5 x 105/godeu înainte de infecție și imunohistochimie. Lamele au fost plasate pe gheață timp de 15 minute și apoi celulele au fost fixate în metanol rece la -20 ° C timp de 15 minute. După îndepărtarea metanolului, celulele au fost incubate în 10% ser normal de capră (NGS) diluat în PBS/0,05% Tween 20 (PBS-T) timp de 30 de minute pentru a bloca legarea nespecifică. Un anticorp monoclonal murin (1: 2000) îndreptat împotriva proteinei NIS umane (aa 468-643) 38 a fost apoi aplicat timp de 60 de minute, urmat de spălare în PBS-T. Celulele au fost apoi incubate cu imunoglobulină anti-șoarece biotinilată de capră (1: 200) timp de 20 de minute. Celulele au fost spălate și apoi s-a aplicat streptavidină conjugată cu peroxidază (1: 300) timp de 20 de minute. După spălare, detectarea a fost efectuată folosind un kit de substrat peroxidazic care conține cromogen diaminobenzidina (DAB) (Vector Laboratories, Burlingame, CA, SUA). Celulele au fost contracolorate cu verde de malachit timp de 5 minute înainte de placare cu mediu de montare Dako® Glycergel (Carpintoria, CA, SUA).

Creșterea xenogrefelor ovariene la șoareci

Șoarecii goi athimici femele (Harlan Sprague - Dawley, Indianapolis, IN, SUA) au primit o injecție subcutanată de 1 x 106 celule OVCAR-3 suspendate în 0,2 ml mediu RPMI pe una sau ambele părți. Când tumorile au atins volumul adecvat (

100 mm 3), șoarecii au fost puși pe o dietă săracă în iod cu apă suplimentată cu T4 (5 mg/L) pentru a reduce absorbția de iod în glanda tiroidă. Toate experimentele au fost aprobate și efectuate în conformitate cu liniile directoare ale Clinicii Mayo (Rochester, MN, SUA).

Infecția cu adenovirus a xenogrefelor tumorale

Șoarecilor cu tumori ⩾ 100 mm 3, care au fost menținuți pe o dietă scăzută cu iodură, li s-au administrat injecții intratumorale de 5 x 10 8 PFU de virus recombinant Ad5-CMV-NIS, Ad5-MUC1-NIS sau virus de control într-un volum total de 100 μl de 3% zaharoză/PBS. Tumorile au fost injectate în mai multe locuri pentru a crește dispersia virusului folosind seringi de insulină. Dacă este necesar, tumorile au fost aspirate pentru a elimina lichidul ascitic înainte de injectarea virusului.

Imagistica tumorală in vivo

La 3 zile de la injectarea virusului în tumorile OVCAR-3, șoarecii au fost injectați intraperitoneal cu 0,5 mCi 123I și au fost imaginați pe o cameră gamma cu colimator de înaltă rezoluție, de joasă energie. Imaginile în serie au fost obținute în diferite momente de timp de la 1 la 48 de ore după administrarea iodurii.

131 I terapie

Șoarecii au fost grupați în funcție de dimensiunea tumorii OVCAR-3 și injecțiile intratumorale de Ad5-CMV-NIS, Ad5-MUC1-NIS sau virusul de control, așa cum este descris mai sus. La 3 zile după administrarea virusului, șoarecii au fost injectați intraperitoneal fie cu 3 mCi 131 I, fie cu soluție salină (grup martor). Volumul tumorilor transduse și de control NIS a fost monitorizat și comparat săptămânal după administrarea de iodură atât în ​​grupurile 131 I cât și în grupurile saline. Analiza statistică a fost efectuată folosind testul t Student (nepereche). Semnificația statistică a fost indicată de o valoare P ⩽ 0,05.

abrevieri

Mulțumiri

Principala sursă de finanțare pentru această lucrare a fost Fundația Prospect Creek. Sprijinul a fost, de asemenea, obținut de la Mayo Foundation Breast Cancer Grant, Prostate Cancer Grant (CA91956) și Mayo Breast Cancer Program.