viral

  • obiecte
  • abstract
  • Fundal:
  • metode:
  • rezultatele:
  • concluzie:
  • Principalul
  • Materiale și metode
  • Pacienți, evaluare histopatologică și urmărire
  • Măsurători cantitative intrahepatice ale ADN VHB și ADNccc
  • Analiza expresiei genelor prin ARN-sequ
  • analize statistice
  • Aprobarea studiului
  • Rezultatul
  • Caracterizarea încărcăturii virale VHB în tumoare și ficatei neoplazici asociați
  • Număr mai mare de copii cccADN în tumorile mai mici comparativ cu tumorile mai mari
  • Sarcina virală intrahepatică și activitatea virală pe baza ADN-ului seric VHB și a AgHBe
  • Influența activității de replicare virală în ficat tumoral și neoplazic asupra supraviețuirii pacientului și recurenței HCC
  • Expresia genetică asociată cu activitatea de replicare virală în ficatul non-neoplazic
  • Genotip viral și variante în țesutul tumoral și neoplazic al ficatului
  • discuţie
  • Istoria schimbărilor
  • Informatii suplimentare
  • Documente Word
  • Materiale și metode suplimentare
  • Fișiere PDF
  • Tabelele suplimentare 1-8

obiecte

  • Replicarea ADN-ului
  • Icter tip B
  • Carcinom hepatocelular
  • Infecții cu virusuri tumorale

Acest articol a fost actualizat

abstract

Fundal:

Scopul acestui studiu este de a determina efectul ADN-ului virusului hepatitei B intracelulare (VHB), ADN circular sigilat covalent (ADNccc) și activitatea de replicare virală atât în ​​ficat tumoral, cât și în ficat non-neoplazic asupra prognosticului și de a determina relația dintre activitatea de replicare virală și fibroza Ishak. la prezicerea rezultatului după rezecție.

metode:

Sunt incluși 99 de pacienți potențial înrolați tratați cu rezecție hepatică primară pentru VHB-HCC. ADN-ul VHB intracelular și ADNccc au fost cuantificate prin PCR în timp real. Secvențierea ARN (ARN-seq) a fost efectuată la un subset de 21 de pacienți care au avut fie o fibroză hepatică minimă (stadiile 0-2 Ishak), fie o fibroză stadiul final (stadiul 6 Ishak).

rezultatele:

Țesutul tumoral conținea copii mai mici de cccDNA în comparație cu ficatul neoplazic împerecheat, iar tumorile mai mari (> 3 cm) au avut mai puțin ADNccc în comparație cu tumorile mici (-3 cm). Activitatea ridicată de replicare virală în ficatul neoplazic a fost asociată cu o rată mai mare de recurență HCC, independent de stadiul fibrozei Ishak. Genele care s-au corelat cu activitatea replicativă virală în ficatul non-neoplazic (620 gene) au fost diferite de genele asociate cu fibroza în stadiul final (1226 gene). Genele asociate cu activitatea replicativă virală au fost distribuite preferențial în regiunile chr3, chr16 și chr19.

concluzie:

Activitatea de replicare virală în ficatul neoplazic este asociată cu recurența HCC prin mecanisme care sunt diferite de stadiul fibrozei Ishak și sunt independente de stadiul fibrozei Ishak.

Principalul

Virusul hepatitei B (VHB) este un virus ADN învelit care infectează în principal hepatocitele. În cazul unui virion matur, ADN-ul viral este prezent într-o formă circulară eliberată (ADNc) care este parțial dublu catenar. La intrarea în celula gazdă, genomul viral este transportat la nucleu, unde rcDNA este convertit în ADN circular sigilat covalent (ADNccc) (Levrero și colab., 2009). Odată format, conținutul de ADNccc este stabil în hepatocitele în repaus și poate fi redus prin diluare prin diviziune celulară, uciderea celulelor infectate sau suprimare prin citokine antivirale (Belloni și colab., 2012).

Infecția persistentă cu VHB este un factor de risc major pentru dezvoltarea carcinomului hepatocelular asociat cu VHB. Proteinele virale, integrarea genomului viral în genomul gazdei, inflamația, stresul oxidativ și reacțiile fibrotice prelungite asociate cu infecția cronică cu VHB pot juca toate rolurile importante în hepatocarcinogeneză (Xu și colab., 2010; Zhou și colab., 2010; Arzumanyan și colab., 2010). Studiile noastre anterioare au arătat că fibroza în stadiul final (faza 6 a lui Ishak) este asociată independent cu o supraviețuire globală slabă și o rată mai mare de recurență a HCC (Wang și colab., 2013b, 2013c). În plus, studiul nostru anterior folosind probe de țesut hepatic încorporate în parafină non-inotlastice de la 111 pacienți cu HBV-HCC tratați între 1991 și 2008 a arătat că activitatea de replicare virală, așa cum este indicat de proporția de ADNccc din ADN-ul total al VHB, se corelează cu inflamația necrotică Stadiul fibros Ishak și acea activitate de replicare virală ridicată în ficatul neoplazic au fost asociate cu un rezultat slab la pacienții cu VHB-HCC (Wang și colab, 2013c).

Scopul acestui studiu este de a determina dacă efectul activității de replicare virală a VHB asupra rezultatului este mediat de mecanisme independente de fibroză sau secundare. Acest raport descrie rezultatele unei cohorte promițătoare de pacienți, complet diferită de cohorta retrospectivă anterioară. În acest studiu sunt incluse doar datele obținute din probe de țesut proaspăt obținute de la pacienții cu rezecție hepatică primară înscriși în studiu între 2008 și 2013. ADN-ul și cccDNA-ul VHB intracelular și activitatea replicativă virală (raportul ADN-ccc/ADN VHB) au fost măsurate utilizând PCR calitativă standardizată. (Laras și colab., 2006; Volz și colab., 2007; Pollicino și colab., 2011) și comparate în 99 de tumori asociate și probe de țesut hepatic non-neoplazic de la pacienți cu HBV-HCC. Efectul ADN-ului viral intracelular și al replicării virale asupra rezultatului clinic după rezecția chirurgicală pentru vindecare.

Materiale și metode

Pacienți, evaluare histopatologică și urmărire

Aceasta este o analiză prospectivă a 99 de pacienți cu HBV-HCC care au suferit rezecție chirurgicală primară cu intenție la Mount Sinai Medical Center din New York din 2008 până în 2013. Dintre acești pacienți, 90% au documentat terapia antivirală și majoritatea au fost tratați pentru o perioadă scurtă de timp. timp înainte de diagnosticul lor HCC. Majoritatea pacienților au primit un tip de tratament antiviral (82%), 17% au primit două tipuri de tratament antiviral și 1% au primit trei tipuri de tratament antiviral. Agenții antivirali cei mai utilizați au fost entecavir (39%), tenofovir (34%) și adefovir (23%). Alți agenți antivirali, cum ar fi telbivudina, reprezintă 4% din toate terapiile antivirale. ADN-ul seric preoperator a fost determinat dintr-o evidență medicală. În laboratoarele noastre clinice instituționale, nivelurile serice de ADN VHB sunt cuantificate utilizând testul HBV AmpliPrep-COBAS TaqMan HBV cu un interval raportat de 23-2 x 108 UI ml -1 (Faria și colab., 2008). Urmărirea medie a supraviețuitorilor este de 30 de luni.

Probele de rezecție hepatică au fost evaluate de un patolog hepatic. Gradul de fibroză hepatică în țesutul hepatic non-neoplazic a fost evaluat utilizând o metodă Ishak modificată (etapele 0-6) după cum urmează: grad 0 (ficat normal); gradul 1 (extinderea mai multor tracturi portale prin fibroză); stadiul 2 (fibroza tuturor tractelor portale); Etapa 3 (extindere fibroasă a majorității zonelor portalului cu punte ocazională a portalului către portal); etapa 4 (extinderea fibroasă a zonelor portal cu punte semnificativă); etapa 5 (marcată de punte prin noduri ocazionale); și stadiul 6 (ciroză demonstrată cu țesut nodular) (Goodman, 2007; Wang și colab., 2013b). Pacienții cu tumori multiple nu au fost excluși din acest studiu. Patologul a evaluat indicele de activitate histologică (HAI, scor 0-18) reprezentând gradul de grad neinflamator, diferențierea tumorii și invazia vasculară.

Metodologia detaliată de diagnostic și măsurile ulterioare ale pacientului este prezentată în materiale și metode suplimentare.

Măsurători cantitative intrahepatice ale ADN VHB și ADNccc

ADN HBV și ADNccc au fost amplificate din ADN genomic folosind kitul de extracție ADN QIAamp așa cum s-a descris anterior (Qiagen, Valencia, CA, SUA) (Kuang și colab., 2010; Schrader și Iredale, 2011; Wang și colab., 2013c). O metodologie detaliată este inclusă în materialele și metodele suplimentare.

Analiza expresiei genelor prin ARN-sequ

Expresia genică a fost evaluată la un subgrup de 21 de pacienți utilizând tehnologia ARN-seq în ficatul non-neoplazic (Tabelul suplimentar 3). Au fost incluși toți pacienții cu o dimensiune a tumorii mai mică de 5 cm, fie cu fibroză hepatică minimă (stadiile Ishak 0-2, n = 10), fie cu ciroză probabilă sau definitivă (grad Ishak 6, n = 11). ARN-ul total (1-3 μg per probă) a fost prezentat la instalația de bază genomică Mount Sinai pentru analiza controlului calității. O metodologie detaliată pentru ARN-seq este inclusă în materialele și metodele suplimentare.

Nivelul de exprimare a genei a fost estimat utilizând RPKM (valori pe kilobază a modelului exonului la un milion de lecturi cartografiate), care sunt normalizate la lungimea genelor și citirile cartografiate totale într-o singură probă. Genele care s-au corelat cu activitatea replicativă virală au fost identificate folosind testul de corelație Spearman. La P 100 de ori, de la 6607 × 103 copii la 46 × 103 copii, indicând eficacitatea tratamentului cu DNază. Numărul de copii ADN VHB din același grup de probe a scăzut de la 22 x 103 copii la 3 x 103 copii, reflectând o reducere de șapte ori. Numărul de copii ale ADNccc a scăzut de la 1 x 103 copii la 0,3 x 103 copii, reflectând o reducere de trei ori. Prin urmare, testul bazat pe PCR a amplificat atât genomul viral, cât și ADN-ul viral integrat.

Număr mai mare de copii cccADN în tumorile mai mici comparativ cu tumorile mai mari

Tumorile inițiale (mai mici decât mijlocii, -3 cm) au avut un număr mai mare de copii de ADNccc pe celulă din tumoră comparativ cu tumorile mai mari (> 3 cm) (medie: 0 0004 copii pe celulă, n = 57, comparativ cu 0 copii pe celula, n = 42) (Figura 1A). În schimb, numărul de copii ale ADNccc în ficatul non-neoplazic al pacienților cu tumori mici vs. tumori mari nu a diferit. La pacienții cu tumori mici, numărul de copii cccDNA nu a diferit între tumoare și ficatul neoplazic asociat, în timp ce la pacienții cu tumori mai mari, copia tumorilor cccDNA a fost semnificativ mai mică decât ficatul neopinetic asociat. Rezultate similare au fost observate pentru ADN-ul VHB intrahepatic (Figura 1B). Tumora mică și tumorile mari nu au diferit în ceea ce privește activitatea de replicare virală (raportul mediu ADNccc/ADN VHB: 0,09 în tumoarea mică versus 0,06 în tumorile mai mari).

HCC mici (-3 cm) au avut copii ADN cccDN și HBV mai mari comparativ cu HCC mari (> 3 cm). Câmp grafic care prezintă o copie a ADNc ccc per celulă ( A ) sau o copie a ADN-ului VHB per celulă ( B ) în tumoră (bare solide) sau ficat non-neoplazic (bare deschise) la pacienții cu HCC mic (-3 cm) sau HCC mare (> 3 cm).

Imagine la dimensiune completă

Numerele copiilor ADNccc tumorale nu au diferit în comparație cu diferențierea tumorii, invazia vasculară sau producția de α-fetoproteine ​​(datele nu sunt prezentate).

Sarcina virală intrahepatică și activitatea virală pe baza ADN-ului seric VHB și a AgHBe

Dintre pacienții din acest studiu, 90% au documentat terapia antivirală. În ciuda tratamentului antiviral, 49% dintre pacienți prezentau ADN seric VHB detectabil și 96% ADN VHB detectat în țesutul hepatic la momentul rezecției hepatice. Raportul ADN VHB, ADNccc și ADN cccDNA/VHB în ficat tumoral sau non-neoplazic nu a diferit între pacienții cu nedetectabil în comparație cu pacienții cu ADN seric VHB detectabil (Tabelul suplimentar 2).

Starea HBeAg imediat înainte de intervenția chirurgicală a fost disponibilă pentru 67 de pacienți (76% erau HBeAg negativi, în timp ce 24% erau HBeAg pozitivi) (Tabelul suplimentar 2). Raportul ADNccc/ADN VHB în ficatul non-neoplazic a fost semnificativ mai mare la pacienții cu AgHBe negativ, indicând o activitate de replicare mai scăzută în țesutul hepatic, în timp ce toate celelalte proprietăți virale nu au diferit. În plus, proporția pacienților cu AgHBe negativ a fost semnificativ mai mare la pacienții cu activitate replicativă VHB scăzută în ficatul neoplazic comparativ cu pacienții cu activitate replicativă VBH ridicată (93% față de 62%, P = 0,004) (Tabel suplimentar 3). Prin urmare, numai activitatea de replicare a VHB în ficatul neoplazic s-a corelat cu statusul seric al HBeAg.

Influența activității de replicare virală în ficat tumoral și neoplazic asupra supraviețuirii pacientului și recurenței HCC

Rata globală de supraviețuire la 5 ani a 99 de pacienți a fost de 72%, iar rata de recurență a HCC a fost de 44%, conform analizei Kaplan-Meier. Cele mai multe recidive au apărut în decurs de 24 de luni de la rezecția chirurgicală. Efectul ADN-ului total intracelular al VHB, cccDNA și al activității de replicare atât în ​​țesutul hepatic tumoral cât și non-neoplazic asupra rezultatului a fost examinat prin compararea grupurilor prin valorile limită medii (Tabelul 2 și Figura 2A și B). Nici o caracteristică virală în tumoră sau ficat neoplazic nu a fost asociată cu supraviețuirea generală.

Tabel în dimensiune completă

Influența activității de replicare virală (raport ADNccc/ADN VHB) la momentul rezecției hepatice asupra supraviețuirii globale și a ratei de recurență după rezecție. Supraviețuirea generală ( A ) și rata de recurență ( B ) stratificat prin limita medie a raportului ADN cccDNA/VHB în ficat tumoral sau neoplasic a fost construit folosind metoda Kaplan-Meier și comparat folosind testul log-rank sau testul Wilcoxon.

Imagine la dimensiune completă

Activitatea de replicare virală în ficatul non-neoplazic a fost asociată cu ratele de recurență HCC (Tabelul 2 și Figurile 2A și B). Activitatea ridicată de replicare virală (raport ADN cccD/VHB mai scăzut) în ficatul non-neoplazic a fost asociată cu o rată de recurență mai mare (Figura 2B). Activitatea ridicată de replicare virală (raport ADN cccDN/VHB mai scăzut) în ficatul non-neoplazic a fost, de asemenea, asociată cu HAI mai mare (4, 1 vs. 3, 4, P = 0,04) și cu fibroză în stadiu superior (4, 7 vs. 3, 9, P = 0,01), care este în concordanță cu studiul nostru anterior în cohorta retrospectivă (Tabelul suplimentar 3). Când etapa de fibroză a fost adăugată ca covariantă, activitatea de replicare virală în ficatul neoplazic a fost încă semnificativ asociată cu recurența HCC prin regresia riscurilor proporționale Cox (HR: 2, 1 (1, 0-4, 5), P = 0,04), sugerând că activitatea de replicare virală contribuie la recurența HCC independentă de fibroză.

Expresia genetică asociată cu activitatea de replicare virală în ficatul non-neoplazic

Ipotezăm că activitatea de replicare virală și fibroza în ficatul neoplazic pot afecta diferite căi biologice implicate în recurența HCC. Semnăturile genetice asociate cu activitatea replicativă virală sau fibroza hepatică în ficatul neoplazic au fost apoi analizate într-un subgrup de 21 de pacienți utilizând ARN-sequ. (Tabelul suplimentar 4). Dintre acești pacienți, 10 au avut fibroză minimă (stadiile Ishak 0-2), în timp ce 11 au prezentat fibroză stadiul final (stadiile Ishak 6). Toți cei 21 de pacienți au avut HCC -11), care este setul de gene reglate în jos atunci când locusul ZNF217 a fost amplificat la 20q13. cancer (Ginestier și colab., 2006). ZNF217 este o proteină de deget de zinc care este adesea amplificată la 20q13 în cancerul de sân (Krig et al., 2010). Proteinele degetului de zinc în ansamblu au fost îmbogățite în setul de gene VRAA (îmbogățire de 1,6 ori, P = 0,01).

Există 1226 de gene care au fost exprimate diferențial în ficatul neopinetic în stadiile fibrozei Ishak 0-2 în comparație cu stadiul Ishak 6 (Tabelul suplimentar 6). Aceste gene au fost îmbogățite funcțional pentru trei semnături legate de cancerul hepatic (Tabelul suplimentar 7). Genele asociate cu faza de fibroză Ishak s-au suprapus ușor cu genele din setul de gene VRAA și au fost identificate doar 26 de gene comune (Tabelul suplimentar 8).

De asemenea, s-a determinat dacă aceste gene exprimate diferențial sunt îmbogățite în orice poziție cromozomială. Genele VRAA au fost îmbogățite în regiunile chr19, chr16 și chr3 (P

Tumora a avut o copie mai mică de ADNccc per celulă comparativ cu ficatul neoplazic. Acest lucru se poate datora diluării prin divizarea celulelor tumorale. Într-un model de șoarece de activator de plasminogen urokinază/imunodeficiență combinată severă (SCID), proliferarea hepatocitelor induce pierderea ADNc (Lutgehetmann și colab., 2010). Studiile efectuate pe un model de rață au arătat că terapia antivirală induce o reducere mai mare a ADNccc la animalele cu proliferare mai mare a hepatocitelor (Addison și colab., 2002). Datele noastre sugerează, de asemenea, un rol pentru diviziunea celulară în reglarea numărului de copii cccDNA, deoarece s-a constatat că tumorile mici conțin un număr mai mare de copii cccDNA decât tumorile mari; și la pacienții cu tumori mici, numărul de copii ale ADNccc în tumoră nu a diferit de numărul ficatului ne-neoplazic asociat.

Observația noastră asupra nivelurilor mai scăzute de ADNccc în tumoră este în concordanță cu un raport recent de 42 de pacienți cu HBV-HCC (Wang și colab., 2013a), dar diferă de un raport anterior cu 25 de pacienți cu HBV-HCC care au copii mai mari ale ADNccc în tumoare ca pacienți fără ficat neoplazic (Wong și colab., 2006). Motivele diferențelor față de studiul anterior nu sunt clare, deși studiul nostru a cuantificat numărul de copii ale ADN-ului HBV și ADNccc per celulă prin măsurarea și normalizarea numărului de copii ale albuminei în toate eșantioanele și fără calcularea numărului de celule pe baza unei estimări de 6,667. ADN genomic pg pe celulă (Wong și col., 2006).

Studiile noastre retrospective anterioare au arătat că activitatea de replicare virală în ficatul neoplazic este asociată cu o supraviețuire globală slabă după rezecția chirurgicală, dar nu și cu o supraviețuire fără recurență. Acest studiu actual diferă de acest studiu în mai multe moduri. Acest studiu actual a inclus pacienți cu rezecție chirurgicală din 2008 până în 2013, în timp ce studiul anterior a inclus pacienți din 1991 până în 2008. De asemenea, ar trebui remarcate unele diferențe, cum ar fi dimensiunea mai mică a tumorii în studiul actual (4, 3 ± 3, 6 versus 7,3 ± 5,0 cm). În acest studiu, ADN-ul viral a fost măsurat folosind probe proaspete de rezecție chirurgicală, în timp ce în studiul anterior, ADN-ul viral a fost măsurat folosind ADN izolat din blocuri de parafină arhivate. În ciuda tuturor acestor diferențe, acest studiu actual confirmă observațiile noastre anterioare că activitatea de replicare virală se corelează cu stadiul HAI și Ishak și că activitatea ridicată de replicare virală este asociată cu un rezultat slab. Pe măsură ce acești pacienți continuă să fie monitorizați, impactul activității de replicare virală asupra supraviețuirii fără recurență și a supraviețuirii globale va fi evaluat în continuare.

Pe scurt, acest studiu oferă o comparație directă a activității ADN intracelular de VHB, ADNccc și replicare virală în ficat tumoral și nonplastic. Datele au arătat că activitatea de replicare ridicată în ficatul non-neoplazic este asociată cu o rată mai mare de recurență a HCC prin mecanisme care sunt diferite și independente de stadiul fibrozei Ishak.

Istoria schimbărilor

Informatii suplimentare

Documente Word

Materiale și metode suplimentare

Fișiere PDF

Tabelele suplimentare 1-8

Această lucrare este publicată pe baza unei licențe standard pentru publicarea unui contract. După 12 luni, lucrarea devine disponibilă în mod liber, iar termenii licenței trec la o licență non-publică Creative Commons Attribution-Noncommercial-Share Alike 4.0.