obiecte

abstract

Blocarea chimiochinelor CC este o strategie terapeutică atractivă, dar încă neexploatată. Raportăm farmacocinetica in vivo a unei proteine ​​chemokine a virusului vaccinia cu spectru larg (35 K) fuzionată cu IgG1 Fc uman. Am arătat că activitatea in vivo a unei proteine ​​poate fi interogată folosind eliberarea genelor hidrodinamice a unei plasmide de expresie standard la mamifere. Nivelurile plasmatice ridicate de proteină 35 K-Fc sunt menținute timp de cel puțin 14 zile după transferul genelor, proteina fiind încă detectabilă după 5 săptămâni. Confirmăm că proteina are activitate biologică în inflamația acută, ceea ce determină o reducere semnificativă a recrutării monocitelor în timpul peritonitei induse de zymosan. Capacitatea 35-K-Fc de a bloca patologii mai complexe este demonstrată folosind digestii aortice pentru a determina recrutarea mediată de angiotensină II a leucocitelor în aortă. Angiotensina II determină reglarea în sus a mCCL2 în aortă, ceea ce determină acumularea celulelor CCR2 +. Vârful recrutării monocitelor în aortă are loc în decurs de 3 zile și acest proces este dependent de chimiokinele CC, în timp ce este redus semnificativ prin administrarea hidrodinamică de 35 K-Fc.

Bolile inflamatorii cronice, cum ar fi ateroscleroza și artrita reumatoidă, sunt o cauză majoră de mortalitate și morbiditate. Citokinele și chemokinele sunt mediatori importanți ai inflamației în aceste condiții și, deși există o modulare a biologiei citokinelor de către terapeutica biologică, cum ar fi Etanercept, o proteină de fuziune Fc care conține receptorul TNF și, astfel, acționează ca un receptor de momeală, foarte limitat 1. Deși antagonismul CCR5 pentru a bloca intrarea HIV de către Maraviroc a avut succes, până în prezent nu există medicamente autorizate care să vizeze chemokinele pentru boli inflamatorii cronice .

Chimiochinele sunt mediatori mici de proteine ​​solubile care reglează transmiterea leucocitelor. Producerea acestor molecule în locurile de inflamație sau infecție controlează recrutarea leucocitelor. Când acest proces devine excesiv sau este inițiat în mod necorespunzător, pot apărea inflamații cronice și leziuni patologice ale țesutului 2. Mulți agenți patogeni exprimă proteine ​​care facilitează evadarea imunitară a gazdei prin neutralizarea aspectelor răspunsului gazdei, cum ar fi producția de chemokine 3. Virusul vaccinia codifică o proteină solubilă de 35 kDa, 35 K, care se leagă de toate chimiochinele CC umane și murine, de obicei la afinități de legare mai mari decât afinitățile de legare pentru legarea receptorilor nativi 4, 5, 6. Am arătat anterior că transferul genei de 35 K mediat de adenovirus sau lentivirus este eficient în reducerea aterosclerozei și a bolii grefei venoase 7, 8. Alte grupuri au raportat suprimarea inflamației alergice pe pielea cobaiului și modelele de inflamație a căilor respiratorii 5, 9. În timp ce eliberarea de virus a demonstrat utilitatea blocării chimiokinelor anti-CC în modelele de boală preclinică, este incapabilă să abordeze problemele de dozare și este puțin probabil să fie aprobată pentru terapia umană dacă este necesar transferul de gene.

Fc-proteine ​​de fuziune sunt acum bine stabilite ca terapeutice cu nouă aprobate în prezent de FDA 10. Adăugarea domeniului Fc, IgG1 uman în cazul fuziunilor Fc autorizate în prezent, are multiple avantaje în construcția de noi agenți biologici. Domeniul Fc este capabil să se lege de receptorii Fc neonatali (FcRn), care sunt exprimați pe celule endoteliale, epiteliale și anumite celule leucocitare. Legarea moleculei de FcRn protejează molecula de descompunerea lizozomală, în schimb moleculele sunt capturate prin godeuri acoperite cu clatrin, în timp ce se leagă în continuare de FcRn, care le țintește către compartimente endosomale care le permit să se întoarcă la suprafața celulei și să revină la circulație. 11. Această proprietate are un efect dramatic asupra timpului de înjumătățire plasmatică, IgG uman având un timp de înjumătățire de 23 de zile. Abatacept, o proteină de fuziune CTLA-4 Fc, are un timp de înjumătățire mai mare de 10 zile 10 .

Proteinele de fuziune Fc facilitează, de asemenea, purificarea noilor produse biologice, permițând utilizarea tehnologiilor standard de purificare a anticorpilor și detectarea acestora pentru studii farmacocinetice de către reactivi de detectare a Fc foarte specifici 12. Deși acest lucru poate facilita construirea și producerea de noi molecule în condiții de laborator, mai degrabă decât industriale, capacitatea de a produce cantități mari de proteine ​​cu o contaminare minimă cu endotoxine poate fi totuși costisitoare și consumatoare de timp. Am combinat experimente de producție de proteine ​​la scară mică pentru a demonstra farmacocinetica unei doze unice și biodisponibilitatea sistemică a proteinei noastre de fuziune de 35 K-Fc, cu livrarea hidrodinamică a aceleiași plasmide de expresie de mamifer utilizate pentru a produce proteina, pentru a permite eficacitatea proteinelor fără mai întâi, trebuie elaborate strategii de dozare multiple sau trebuie produse cantități mari de proteine ​​de fuziune foarte purificate. Folosind administrarea hidrodinamică, am demonstrat utilitatea in vivo a proteinei noastre care leagă chimiokina CC, mutantul R89A 35 K-Fc, pe care l-am demonstrat pentru prima dată, este eficient într-un model acut de inflamație vasculară.

Materiale și metode

materiale

Dacă nu se specifică altfel, toate mediile și tampoanele de cultură celulară au fost obținute de la Invitrogen (Marea Britanie). Toate substanțele chimice de laborator provin de la Sigma-Aldrich (Gillingham, Marea Britanie), cu excepția cazului în care se menționează altfel.

Toate studiile efectuate pe animale au fost efectuate cu aprobarea etică a Comitetului local de revizuire a eticii și în conformitate cu Legea din 1986 pentru animale la biroul de acasă din Regatul Unit (Proceduri științifice) din 1986. Șoarecii au fost adăpostiți în cuști ventilate individual, cu un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore și temperatură controlată 20 ° C). C - 22 ° C). Hrana standard (Harlan, Marea Britanie) și apa erau disponibile ad libitum. Șoarecii C57bl/J au fost achiziționați de la Harlan UK sau șoarecii homozigoti B6.129P2-Apoe tm1Unc/J care au fost adăpostiți în interior au fost folosiți pentru experimente.

35 Producția de proteine ​​K-Fc și farmacocinetica

Proteina 35 K-Fc a fost produsă prin transfectarea plasmidelor de expresie în celule 293T și purificată prin afinitate cu proteina A, după cum sa publicat mai sus 13. Studiile farmacocinetice au fost efectuate prin injectarea ip a 5 μg de proteină 35 K-Fc, urmate de spălare peritoneală și prelevare de probe de plasmă la timpii de colectare. Spălarea peritoneală a fost obținută prin clătirea peritonealului cu 5 ml PBS/5 mM EDTA post-mortem.

Producerea a 35 plasmide K-Fc pentru injectare

35 de versiuni K-Fc și mutante au fost produse în vectorul pSecTag2 (C) (Invitrogen, Paisley Marea Britanie) după cum a fost publicat anterior 13. ADN-ul pentru injecție a fost preparat folosind un kit de ADN cu enodtoxină scăzută Maxi-prep (Qiagen, Marea Britanie) folosind un material plastic de unică folosință fără pirogen. ADN-ul plasmidic a fost solubilizat în apă fără endotoxine de cultură tisulară, alicotat și depozitat la -20 ° C. Nivelul de contaminare cu endotoxine a fost evaluat folosind Limous Amoebocyt Assay (QCL-1000) (Lonza, Marea Britanie).

Livrare hidrodinamică

leagă

5 μg de 35 K-Fc au fost injectați ip la șoareci C57bl/6J. Cavitatea peritoneală a fost clătită cu PBS și plasma a fost preparată din șoareci colectați timp de 7 zile după injecție (n = 3 pe punct de timp). Concentrația de 35 K-Fc în spălatul peritoneal, calculată ca cantitate rămasă pe animal ( A ) și concentrațiile plasmatice ( B ) a fost determinată de ELISA. Bioactivitatea a 35 K-Fc a fost determinată prin bioanaliză chemotaxică. Plasma (10%) a fost utilizată ca chimioatractor în testul de chemotaxie al camerei Boyden. Numărul de celule care migrează la probe de plasmă a fost calculat ca indicele de migrație normalizat la cantitatea de migrație aleatorie observată doar de tampon ( C ). Concentrația plasmatică RANTES 5 a fost măsurată prin ELISA ( D ). Concentrațiile plasmatice de 35 K-Fc corelate cu bioactivitatea plasmatică ( E ). n = 3 pe punct de timp, analiză statistică efectuată de ANOVA unidirecțional și testul de comparație multiplă al lui Dunnett. * p

Șoarecii au fost injectați cu 1 sau 10 ug de plasmidă 35 K-Fc. Plasma a fost colectată la 72 de ore după injectare și imunoprecipitată cu margele de proteină A/G. Proteinele precipitate rezultate au fost identificate prin Western blot folosind anticorpi anti-Fc și anti-35 K cu 35 K-Fc purificat ca martor pozitiv și animale injectate cu soluție salină ca control negativ ( A ). Șoarecii au primit o livrare hidrodinamică de 1 μg de 35 K-Fc plasmidă, cohorte individuale de șoareci au fost colectate între 2 și 14 zile după injectare și probe izolate de plasmă și ficat (n = 3-5 pe moment). Nivelurile plasmatice de 35 K-Fc au fost identificate de ELISA ( B ) și mesajul de 35 K-Fc a fost evaluat folosind sonde taq-man specifice de 35 K într-un experiment RT-PCR în timp real ( C ) (* p

discuţie

Am demonstrat utilitatea in vivo a reactivilor noștri de 35 K-Fc pentru a testa rolul chemokinelor CC în patologie. Am arătat că inhibarea sistemică a spectrului larg al chimiokinelor CC este eficientă în reducerea recrutării celulelor mieloide ca răspuns la peritonita zymosan. De asemenea, am demonstrat că 35K-Fc poate bloca sosirea monocitelor în faza incipientă a inflamației vasculare conduse de AngII și că se observă blocarea preferențială a monocitelor în loc de recuperarea neutrofilelor. În plus, am demonstrat utilitatea platformei noastre pentru testarea noilor proteine ​​de fuziune Fc fără a fi nevoie să producem cantități mari de proteine ​​purificate. Lucrările noastre anterioare au arătat că 35 de mutanți K-Fc au modificat capacitatea de a bloca chemokinele CC in vitro și local in vivo atunci când sunt livrate la locul inflamației. Am demonstrat acum că 35 de proteine ​​K-Fc au o farmacocinetică bună în doză unică și, de asemenea, că au activitate sistemică în patologiile CC-chemokine-dependente stabilite.

Abilitatea de a obține dovezi ale activității biologice, fără producerea unor cantități mari de proteine, face posibilă progresul mai rapid și, în principiu, o gamă mai largă de proteine ​​care urmează a fi testate pentru activitate. O proteină de fuziune 35 K Fc (vCCI) similară cu virusul vacciniei care inhibă chemokinele, testată într-un model de artrită indusă de colagen, a necesitat administrarea de doze multiple de 200 μg pentru a demonstra un efect biologic 29. În timpul experimentului, acest lucru a necesitat livrarea a 2 mg de proteine ​​per șoarece. Acest regim de dozare a fost asociat cu pierderea eficacității și generarea unui răspuns anticorp puternic la vCCI-Fc în termen de 14 zile de la începerea tratamentului 29. Am exprimat lentivirusuri de 35 K și am observat inhibarea funcțională a bolii timp de cel puțin 3 luni, mult mai mult decât s-a realizat cu vCCI-Fc7. Dacă producția unei proteine ​​de fuziune Fc determină un răspuns imun îmbunătățit, potențial prin producerea de neo-antigene, acesta este din nou ceva ce poate fi testat pentru utilizarea plasmidelor modificate, fără a fi nevoie de experimente multidoză folosind proteine ​​modificate.

Terapiile imunomodulatoare puternice, cum ar fi inhibitorii TNFα, prezintă o inhibare puternică a bolilor imune, cum ar fi artrita reumatoidă, dar eficacitatea lor poate fi pierdută în timp, necesitând terapia de linia a doua 30. Eficacitatea citokinelor precum TNFα și a familiei chimiocinelor CC în funcțiile imunitare esențiale, precum controlul infecțiilor, ridică îngrijorări reale cu privire la raportul cost-beneficiu al efectelor benefice asupra bolii față de compromiterea capacității organismului de a controla infecțiile și cancerele. Cu toate acestea, succesul terapiilor TNFα-Fc indică faptul că pacienții bine monitorizați pot beneficia foarte mult de terapiile anti-citokine. Asocierea chimiochinelor CC cu atâtea afecțiuni cronice, cum ar fi ateroscleroza, artrita și boala gastro-intestinală, indică faptul că inhibitorii chimiochinelor CC, cum ar fi mutanții noștri de 35 K-Fc, pot avea utilitate atât ca instrumente experimentale pentru a testa rolul acestei clase de moleculă și ca potențiali agenți terapeutici 2 .

Mai multe detalii

Cum se citează acest articol: McNeill, E. și colab. Livrarea genelor hidrodinamice a proteinelor de fuziune Fc de legare a chemokinelor CC către ținta inflamației vasculare acute in vivo. Știință. reprezentant. 5, 17404; doi: 10.1038/srep17404 (2015).