20 iunie 2012, autorul articolului: Lazárová Katarína, Medicament
Volumul 5, numărul 6 Adăugați o postare
Considerăm că osteoporoza este o boală multifactorială care duce la scăderea calității vieții, deoarece o scădere a rezistenței osoase duce la o scădere a rezistenței osoase. În prezent, comunitatea științifică acordă o atenție deosebită analizei genelor candidate care se pot corela cu dezvoltarea bolii osteoporotice. Acest studiu se concentrează pe analiza genei OPG.
1. Introducere
Osteoporoza este una dintre cele mai frecvente boli ale populației. Afectează în principal persoanele în vârstă, ambele sexe și toate grupurile etnice. Osteoporoza se caracterizează printr-o scădere a masei osoase și întreruperea microarhitecturii. Acești factori conduc la o frecvență crescută a fracturilor. Riscurile osteoporozei pot fi modificabile, în funcție în principal de stilul de viață și de riscurile fixe, care sunt ereditare. [1]
FIG. 1 Comparația masei osoase a osului sănătos și a oaselor afectate de osteoporoză [2]
2. Predispoziții genetice la osteoporoză
După cum sa menționat deja, osteoporoza este o boală multifactorială care afectează interacțiunea dintre influențele de mediu și gene, precum și între genele în sine. În multe cazuri, a fost confirmată asocierea dintre polimorfismele genetice implicate în metabolismul osos și dezvoltarea bolii osteoporotice. Polimorfismele din multe gene se corelează cu debutul acestei stări patologice. Acest lucru este indicat și de rezultatele analizelor din studii de gemeni și familii, care sugerează că moștenirea BMD variază de la 25% la 85%. Influența eredității joacă fără îndoială un rol crucial în reglarea masei osoase și, cu excepția cazurilor rare, moștenirea DMO este poligenică. [1]
În cadrul predispozițiilor genetice care pot duce la această afecțiune patologică, distingem multe gene. Una dintre cauze pot fi polimorfismele din gena pentru OPG (gena care codifică osteoprotegerina), VDR (gena care codifică receptorul vitaminei D), LRP 5 (proteina receptorului lipoproteinei 5), polimorfismul genei COLIA (gena colagenului), TGF-β1 gene (gena care codifică factorul de creștere transformator), IGF-1 (gena care codifică factorul de creștere a insulinei) și gena pentru IL6 (gena pentru interleukina 6). [3]
OPG
OPG a fost identificat în timpul unui proiect ADNc de șobolan. Acest grup de cercetători s-a ocupat de receptorul TNF. OPG joacă un rol important în osteoblastogeneză. Efectul său biologic este de a inhiba activitatea și diferențierea osteoclastelor. Osteoporoza severă a fost observată la șoareci cu ștergere țintită a genei OPG. DMO radio distală semnificativ mai mică apare la indivizii homozigoti pentru alela recesivă (GG) comparativ cu heterozigoți și homozigoți pentru alela dominantă la SNP 245T/G și 163A/G. OPG și RANKL sunt asociate cu apariția fracturilor osoase și a DMO în coloana vertebrală și regiunea lombară. [4]
Polimorfism A163G
Polimorfismul A163G este identificat în regiunea promotorului OPG. Incidența polimorfismului A163G a fost semnificativ predominantă la pacienții cu fracturi vertebrale. Într-un studiu al femeilor caucaziene aflate în postmenopauză, experții au relevat o asociere între polimorfismul A163G și incidența fracturilor lombare și ale încheieturii mâinii. [5]
Fig.2 Polimorfisme în regiunea proximală a OPG [4]
3. Material și metodologie de lucru
Izolarea ADN-ului din sânge
În această lucrare, am folosit tampoane bucale și probe de sânge periferic obținute de la pacienții diagnosticați cu osteoporoză, care au fost furnizate de Osteocentrum Prešov. EDTA a fost utilizat ca anticoagulant în probele de sânge. Am analizat 110 eșantioane, respectând toate standardele etice și legale necesare pentru desfășurarea cercetării.
Materiale și substanțe chimice pentru izolare:
Pentru a izola ADN-ul din probele de sânge periferic, am folosit kitul de izolare a ADN-ului din sânge UltraClean® (Non-Spin), care este conceput pentru a izola ADN genomic cu greutate moleculară mare. Substanțe chimice individuale: tampon G1, G2, RNază A, G3, 100% izopropanol, 70% etanol, tampon G4. Material și dispozitive: ependorfs, pipete, vârfuri pentru pipete, vortex, centrifugă Hettich Mikro 200R, termostat CH-100.
Procedura pentru introducerea reacției PCR în timp real:
- Produse chimice și materiale PCR în timp real:
- Produse chimice:
- TaqMan® Genotyping Master Mix, Applied Biosystems by Life Technologies, Foster City, California, SUA,
- TaqMan rs3102735; C___1971046_10, Applied Biosystems by Life Technologies, Foster City, California, SUA
- H2O de la Milipor
- Material:
- Placă de reacție MicroAmpTM Fast Optical cu 48 de godeuri (0,1 ml), Applied Biosystems by Life Technologies, Foster City, California, SUA
- Film adeziv optic cu 48 de godeuri MicroAmp®, Biosystems aplicate de Life Technologies, Foster City, California, SUA
- pipete de diferite volume, vârfuri de pipete
- Produse chimice:
- Dispozitive:
- Centrifugă multifuncțională JOUAN B4i, Cabinet de siguranță biologică Esco Clasa II (BSC)
- Sistem StepRe PCR în timp real cu biosisteme aplicate de control computerizat de Life Technologies, Foster City, California, SUA
StepOne Real-Time PCR oferă posibilitatea de a analiza datele dintr-o varietate de perspective utilizând un afișaj cu mai multe componente. Avantajul acestui dispozitiv este că este capabil să identifice eșantionul, resp. o gaură în placă care ar putea afecta negativ întreaga analiză. Este capabil să detecteze coloranții FAM, VIC, SYBR Green, ROX. StepOne determină poziția și intensitatea semnalelor de fluorescență, coloranții asociați cu fiecare fluorescență și semnificația fiecărui semnal.
Am folosit sonda pentru a amplifica secțiunea dorită a genei OPG: TaqMan rs3102735; C___1971046_10
Localizare: cromozomul 8
Organism: Homo sapiens
Pedigree: Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrate; Euteleostomie; Mammalia; Eutheria; Euarchontoglires; Primate; Haplorrhini; Catarrhini; Hominidae; Homo
contextul secvenței (VIC/FAM):
CTCTAGGGTTCGCTGTCTCCCCCAT [C/T] AATTCCCTGGTCTAGAAGTTAGACT
polimorfism: transmisie C/T
simbolul genei: TNFRSF11B OPG; TR1; OCIF (www.bioinfo.appliedbiosystems.com)
| 60 ° C | 95 ° C | 92 ° C | 60 ° C | 60 ° C |
| 00:30 | 10:00 | 0:15 | 1:30 | 1:30 |
| da | nu | nu | da | da |
4. Rezultate și discuții
Grupul analizat a fost format din 110 persoane diagnosticate cu osteoporoză. Am analizat probele folosind metoda PCR în timp real. În acest studiu, am examinat polimorfismul genei OPG A163G, care este cel mai frecvent descrisă în asociere cu osteoporoză.
Tab. 1 Compoziția vârstei medii a indivizilor din grupul analizat
| numărul de persoane din fișierul analizat | 101 | 9 |
| procent | 91,8% | 8,2% |
| intervalul de vârstă | 33-83. | 47-79 r. |
| varsta medie | 64 r. | 61r. |
Cea mai mare frecvență de apariție în grupul analizat a fost înregistrată la genotipul AA cu o frecvență de 74,55%. Am detectat apariția genotipului GG cu o frecvență de 4,55%. Genotipul AG a fost identificat în 20,90% din probele analizate. Conform legii lui Hardy-Weinberg, distribuția genotipurilor individuale a fost în echilibru, după cum este documentat de rezultatul testului Chi-pătrat. Prin compararea frecvențelor alelelor, am detectat o frecvență mai mare a apariției alelei A în setul analizat, care a avut loc la o frecvență de 0,85. Frecvența apariției alelei G a fost de 0,15.
Tab. 2 Frecvența genotipurilor și alelelor polimorfismului A163G în gena OPG
| 110 | AG | AA | GG | 3.5 P = 0,06578 | A | G |
| A | 82 | 23 | 5 | 0,85 | 0,15 | |
| CU | 74,55% | 20,90% | 4,55% | |||
| T | 79,5 | 28.05 | 2.5 |
P - P valoare, A - număr absolut, S - frecvențe observate în procente, T - număr teoretic conform legii lui Hardy-Weinberg.
Rezultatele obținute sunt comparabile cu rezultatele studiilor altor autori, cum ar fi cu analiza lui Zajíčková și colab. (2008) care au analizat 165 de probe în studiul lor pentru prezența polimorfismelor A163G, T245G, G1181C.
Graficul 1. Compararea procentelor de genotipuri individuale [6]
Bentle și colab. (2002) într-un studiu asupra polimorfismului OPG în asociere cu fracturi osteoporotice au abordat și polimorfismul A163G. Frecvența genotipurilor a fost următoarea: AA: 66,5%, AG: 27,9%, GG: 5,6%. În studiul lor, au analizat, de asemenea, probe de control. Comparativ cu grupul osteoporotic, aceștia au înregistrat o frecvență mai mare a genotipului AA: 74,4% și o incidență mai mică a heterozigoților AG: 22,8% și homozigotilor GG: 2,8%.
Graficul 2. Compararea geontipurilor de studiu Bentle L. și colab. și analiza noastră [5]
5. Concluzie
Osteoporoza este în prezent o problemă gravă în populația actuală a lumii. Este o uriașă problemă de sănătate și socio-economică. Costurile asociate cu tratamentul osteoporozei sunt mari. Un mic procent din populație este informat că osteoporoza este considerată o boală a civilizației care duce la o scădere rapidă a calității vieții și, în multe cazuri, este cauza morții. Din aceste motive, este mai bine să preveniți această boală, dacă este posibil.
Gena OPG este una dintre „genele candidate” în legătură cu predispozițiile genetice la osteoporoză. Polimorfismele din această genă se corelează cu diverse fenotipuri osoase, inclusiv fracturi. Aceste rezultate și concluzii sunt doar primul pas în prevenirea osteoporozei. Osteoporoza poate fi prevenită prin stilul de viață potrivit. Un stil de viață important aici joacă un rol important, care este consumul suficient de produse lactate și pește, aportul de vitamina D și suficient exercițiu.
Lista literaturii folosite