obiecte

abstract

Nutriția enterală cu lapte de vacă este asociată cu enterocolită necrozantă neonatală (NEC) și sepsis. Sensibilizarea antigenului alimentar poate juca un rol în promovarea și/sau menținerea inflamației în ambele condiții. Pentru a investiga răspunsurile citokinelor specifice proteinelor din laptele de vacă (CMP) la sugarii prematuri cu NEC și sepsis, au fost admiși 14 sugari cu NEC, 14 controale sănătoase consensuale și 10 martori septici. Celulele mononucleare din sângele periferic nestimulat și stimulat (PBMC) care secretă IFN-γ, IL-4, IL-10 și TGF-β1 au fost numărate printr-un test imunosorbent legat de enzimă cu o singură celulă (ELISPOT). În timpul fazei acute a NEC, pacienții au prezentat un model general al nivelurilor ridicate de secreție de citokine atunci când nu sunt stimulați și stimulați de mitogeni [fitohemagglutinină (PHA)] și CMP: beta-lactoglobulină (β-Ig) și cazeină. Aceste răspunsuri au fost mai pronunțate pe β-Ig pentru IFN-γ, IL-4 și IL-10 decât TGF-β1. Răspunsurile citokinice în sepsis au fost mai mici decât în ​​NEC (cel mai scăzut la controalele sănătoase cu răspuns TGF-β1 minim). De-a lungul timpului, frecvențe mai mici ale celulelor secretoare de citokine au fost induse decât în ​​timpul fazei acute, cu excepția celulelor secretoare de TGF-β1, care au crescut la termen (ca răspuns la PHA și CMP) în principal după NEC, dar și după sepsis.

răspunsuri

Principalul

Enterocolita necrozantă neonatală (NEC) și sepsisul se numără printre cele mai frecvente complicații în UCIN (1). În ambele cazuri, incidența bolii este invers proporțională cu greutatea la naștere și GA (2). NEC reprezintă un grup eterogen de boli intestinale, care include un spectru de prezentări clinice și diferite grade de inflamație intestinală (3). Patogeneza NEC este considerată multifactorială, dar nu este pe deplin înțeleasă. Au fost identificați mai mulți factori predispozanți, inclusiv consumul prematur, alimentarea cu lapte, hipoxia/ischemia intestinală și translocația bacteriană. NEC apare de obicei la sugarii prematuri (4) care sunt, de asemenea, deosebit de predispuși la sepsis (5).

Majoritatea cazurilor de NEC apar la copii hrăniți enteric. Natura furajului enteral pare a fi un factor patogen important. Studiile epidemiologice sugerează un risc crescut de NEC la sugarii hrăniți cu lapte de vacă comparativ cu cei care primesc lapte matern (mamă sau donator) (6). Legătura potențială dintre NEC și laptele pe bază de lapte a fost până acum investigată în mare măsură prin identificarea elementelor imunoprotectoare din laptele matern și determinarea efectului tipului de lapte (rețetă sau sân) asupra dezvoltării microbiozei intestinale (7). Beta-lactoglobulina (β-Ig), despre care nu se știe că există în mod normal în laptele matern uman, reprezintă 8,5% din compoziția proteinelor din proteinele din laptele de vacă (CMP), în timp ce cazeinele reprezintă 80% din CMP (8).

Deși sistemul imunitar al sugarilor prematuri a fost considerat relativ „imatur” în comparație cu sistemul imunitar al sugarilor adulți, sugarii prematuri pot răspunde în mod adecvat la stimulii antigenici. Cu toate acestea, se știe puțin despre răspunsurile imunologice ale acestor copii la antigenele dietetice (9), fie într-o stare „sănătoasă”, fie poate mai important, în stările de boală care pot include o barieră mucoasă precum NEC și sepsis.

Am demonstrat anterior sensibilizarea la CMP la copiii cu NEC, unde stimularea in vitro a celulelor mononucleare din sângele periferic (PBMC) cu cazeină și β-Ig a indus un răspuns efector al ambelor tipuri de celule T helper (Th): Th1 (IFN-γ) ) și Th2 (IL). -4 și 5) (10).

În acest studiu, am folosit metoda Sensitive Enzyme Immunospot (ELISPOT), care permite detectarea secreției de citokine la nivelul unei singure celule și am investigat în continuare acest fenomen. Au fost evaluați copiii cu NEC, controale sănătoase și sugarii cu sepsis. Pe lângă reexaminarea secreției de IFN-γ și IL-4, am caracterizat și citokinele de reglare IL-10 (secretate de celulele de reglare Th tip 1) și TGF-β1 (secretate de Th3) de către PBMC. În plus, am repetat toate evaluările în momentul în care nou-născuții s-au recuperat din NEC și sepsis în comparație cu controalele sănătoase pentru a măsura modificările răspunsurilor citokinelor în timp.

SUBIECTE ȘI METODE

Subiecte.

Treizeci și opt de prematuri admise la UCIN la Spitalul Chelsea & Westminster între februarie 2006 și august 2007 au fost admiși în trei grupe de studiu: 14 sugari prematuri cu NEC [Bell modificat (11) gradul II: opt cazuri și gradul III: șase cazuri] care au fost identificați și primiți în termen de 24 de ore după diagnostic; 14 pacienți sănătoși de control fără antecedente de NEC sau sepsis care au fost ajustate individual pentru selecție paralelă pentru vârsta postconcepțională (PCA) și vârsta postnatală (PNA) comparativ cu pacienții cu NEC; și 10 nou-născuți cu debut tardiv (> 1 an) de sepsis hemocultură pozitivă (martori septici) care corespund, deși nu individual, PCA și PNA pacienților cu NEC și martori sănătoși.

Izolarea PBMC.

Aproximativ 0,5 ml de sânge heparinizat au fost colectați de la sugari în trei grupuri la diagnostic și apoi la termen. PBMC-urile au fost izolate prin centrifugare cu gradient de densitate folosind proceduri standard. Celulele au fost spălate în mediu complet (R10) conținând RPMI 1640 7 (Sigma Chemical Co.-Aldrich, Gillingham, Marea Britanie), 50 U/ml penicilină, 50 ug/ml streptomicină, 10 ug/ml gentamicină, 2 mm glutamină, sodiu. piruvat, 10 mmoli de tampon de acid 4- (2-hidroxietil) -1-piperazin-etansulfonic (HEPES) și 10% FCS inactivat termic. Concentrația PBMC a fost determinată utilizând un contor de particule Z1 (Beckman Coulter, High Wycombe, Marea Britanie). Procentul de celule viabile a fost determinat de secreția de albastru tripan.

Acoperiți placa cu anticorpi captori.

O placă de microtitrare de bază cu nitroceluloză (MAIPS 4510; Millipore, Watford, Marea Britanie) a fost pre-umezită cu 20 pl/godeu de alcool etilic 70% timp de 5 minute la temperatura camerei. Alcoolul a fost decantat și godeurile au fost spălate de trei ori cu 200 μl PBS și acoperite cu un anticorp de captură monoclonal specific citokinei în 100 μl PBS (1 μg/godeu pentru IFN-γ, IL-4 și IL-10 și 0,3 μg/bine). pentru TGF-β1). Placa a fost incubată cel puțin peste noapte și până la 1 săptămână la 4 ° C într-o pungă sigilată. Imediat înainte de utilizare, anticorpul nabsorbit a fost decantat și godeurile au fost spălate de trei ori cu PBS și blocate cu 200 pl/godeu R10 timp de 2 ore la 37 ° C într-o atmosferă umidificată cu 5% CO 2.

Incubația PBMC.

Mediul de blocare a fost decantat și PBMC au fost adăugate la 0,5 x 105 celule per godeu în triplicat pentru fiecare stimul. Celulele au fost incubate timp de 20-24 de ore într-o atmosferă de 5% CO 2, la 37 ° C în absența sau prezența antigenilor sau mitogenilor corespunzători: hemocianină de limpet gaură (KLH; 500 μg/ml), β-Ig (500 μg/ml), cazeină (500 μg/ml) și fitohemaglutinină (PHA; 10 μg/ml; Sigma Chemical Co.-Aldrich).

Detectarea celulelor secretoare de citokine.

Godeurile au fost spălate de șase ori cu PBS conținând 0,05% Tween 20 (200 pl/godeu; Sigma Chemical Co.). S-a adăugat anticorp monoclonal specific citokinic biotinilat filtrat de 0,4 μm (MAb) în 100 μl volume/godeu (0,1 μg/godeu, diluat în PBS/0,5% BSA) și incubat timp de 4 ore la temperatura camerei.

Captarea și detectarea MAb pentru IFN-γ și IL-4 au fost obținute de la MAbtech AB (Nacka Strand, Suedia), în timp ce anticorpii la IL-10 de la BD Biosciences (San Diego, CA) și cei de pe TGF-β1 au fost capturați (Ab: himeră umană recombinantă TGF-βRII/Fc și anticorp anti-TGF-β1 biotinilat) au fost obținute din sisteme de cercetare și dezvoltare (Regatul Unit). La sfârșitul perioadei de incubație, godeurile au fost spălate de șase ori cu PBS/0,05% Tween 20 și 100 μl de complex avidin-biotin-peroxidază (ABC; Vector Laboratories, Burlingame, CA) preparat conform instrucțiunilor producătorului. 1-2 ore la temperatura camerei. Godeurile au fost spălate de trei ori cu 200 pl PBS/Tween 20, apoi de trei ori cu 200 pl PBS și, în final, s-au adăugat 100 pl substrat de aminoetilcarbazol (AEC) (Sigma Chemical Co.-Aldrich) la fiecare godeu. Pata s-a dezvoltat la temperatura camerei timp de 4 minute înainte de spălare cu apă de la robinet și uscare peste noapte. Spoturile au fost numărate folosind un cititor de plăci ELISPOT (Carl Zeiss, Welwyn Garden City, Marea Britanie). Rezultatele finale au fost exprimate ca celule colorate (SFC) la 105 PBMC.

Statistici.

Datele din fiecare dintre cele trei grupuri au fost testate pentru normalitatea distribuției și s-au dovedit a fi neparametrice. Diferite seturi de analize au examinat patru diferențe în răspunsul citokinelor în fiecare grup atât în ​​acut cât și în termen. Rezultatele sunt exprimate ca mediană și interval intercuartil (IQR) pentru fiecare grup sau ca număr și procent. Comparațiile dintre sugari cu NEC și martorii sănătoși au fost analizate ca date asociată (testul asociat Wilcoxon) ca și comparație între probele de termen și cele acute. Comparațiile cu copiii septici nu au fost potrivite (testul Mann-Whitney). Nivelul de materialitate a fost stabilit la 1%; numai p sepsis; p sepsis; p sepsis; De 4-10 ori; p creștere de 5 ori; FIG. 1).

Creșterea frecvențelor citokinelor secretoare de PBMC la pacienții cu NEC, martori septici și martori sănătoși (AELISPOT) după stimularea p-Ig la prezentare (acută) și la termen (termen). Frecvențele celulelor secretoare ale IFN-γ (A), IL-4 (B), IL-10 (C) și TGF-β1 (D) sunt exprimate ca AFCS la 105 MNC (ASFC la 105 PBMC), reprezentând diferența dintre numărul mediu de pete din godeurile tratate cu antigen și godeurile din godeurile nestimulate la fiecare etapă de prelevare. Fiecare linie reprezintă un subiect. * sepsis p, de 3-5 ori; p creștere de 5 ori; FIG. 2). Stimularea cu KLH a indus răspunsuri neglijabile în toate probele (NEC, sepsis și controale sănătoase la prezentare și la termen pentru cele patru citokine evaluate).

Creșterea frecvențelor citokinelor secretoare de PBMC la pacienții cu NEC, martori septici și martori sănătoși (AELISPOT) după stimularea cazeinei, la prezentare (acută) și la termen (termen). Frecvențele celulelor care secretă IFN-γ (A), IL-4 (B), IL-10 (C) și TGF-β1 (D) sunt exprimate ca AFCS la 105 MNC (ASFC la 105 PBMC), reprezentând diferența dintre numărul mediu de pete din godeurile tratate cu antigen și godeurile din godeurile nestimulate la fiecare etapă de prelevare. Fiecare linie reprezintă un subiect. * p β-lg