obiecte

abstract

Principalul

Macroautofagia (denumită în continuare autofagie) este un proces catabolic foarte conservat și este implicat în diferite funcții celulare. Apare în condiții fiziologice la nivel bazal și joacă un rol în homeostazia celulară prin degradarea proteinelor slab asamblate și a organelor deteriorate. Materialul care urmează să fie degradat este izolat în vezicule cunoscute sub numele de autofagozomi, care în cele din urmă se asociază cu lizozomii. Autofagia este reglementată diferențial în timpul îmbătrânirii și este, de asemenea, implicată în procesele fiziopatologice, inclusiv în cancer. 1, 2, 3 Autofagia canonică răspunde stimulilor de mediu prin diverși factori, care aparțin în primul rând omologilor genici (atg), care sunt identificați inițial în drojdie. Cei doi regulatori majori care reglementează autofagia canonică sunt ținta mamiferelor a complexului rapamicină (mTOR) 1 (mTORC1), care reglează negativ activitatea autofagică, și complexul Beclin1/III fosfatidilinozitol 3-kinază (PI3K). Clase necesare pentru nucleația membranei autofagosomale. Extinderea membranei este realizată de două sisteme de conjugare asemănătoare ubiquitinei (ATG12-ATG5 și ATG8/LC3) și de membrii familiei de proteine ​​ATG18 WD cu un domeniu de interacțiune 1-3 fosfoinozitidă (WIPI1-3) (reglarea autofagiei este bine evaluată în ref. 5 6, 7).

Recent, însă, au fost descoperite căi autofagice necanonice care diferă de semnalizarea canonică prin faptul că nu necesită neapărat acțiunea ierarhică a proteinelor ATG și a complexelor de proteine. De exemplu, căile autofagice non-halonice independente de complexul Beclin1 sau mTORC1 și ULK1 sunt cunoscute sub numele de 9, 10, 11, 12, dar în cele din urmă toate duc la fuziunea autofagozomilor cu lizozomii și degradarea substraturilor din aceste compartimente acide.

În concordanță cu complexitatea căilor autofagice descrise până acum, există numeroase consecințe ale autofagiei în procesele fiziopatologice. Autofagia afectează, de exemplu, formarea precoce a tumorii și menținerea tumorii, precum și eficacitatea intervenției terapeutice. 13, 14, 15, 16 Expresia alterată a proteinelor ATG și activitatea autofagică modificată au fost prezentate într-o varietate de țesuturi canceroase, de la celule stem de glioblastom până la celule canceroase de sân. Recent, s-a demonstrat că athanogenul 3 asociat co-chaperonă Bcl-2 (BAG3), care modulează activitatea autofagică legată de vârstă, reduce selectivitatea autofagiei prin autofagie selectivă și este extrem de exprimat în neuroblastomul receptorului estrogen pozitiv și în cancerul de sân celule. 17, 18, 19, 20, 21

În acest studiu, oferim dovezi că ERα declanșează autofagia necanonică independent de legarea ligandului și de activitatea mediată de factorul de transcripție mediată de ERE în diferite modele de celule tumorale care exprimă ER și din țesutul cancerului de sân uman. Am arătat că reducerea activității autofagice a eliminării BAG3 și blocarea degradării lizozomale sensibilizează celulele ER-pozitive la stres. O analiză detaliată a căii autofagice prezentate aici ar putea deschide noi strategii pentru tratamentul celulelor cancerului de sân α pozitive care nu răspund la tratamentul cu AE sau cu inhibitori ai aromatazei.

Rezultatul

Expresia ER reglează diferențial transcrierea genelor legate de autofagie

ER sunt fie factori de transcripție care interacționează direct cu elemente ale răspunsului estrogen (ERE) și prin interacțiunea cu alți factori de transcripție, fie activează cascade de semnalizare citoplasmatică. Deoarece ER α și β sunt de obicei coexprimate, analiza diferențială a funcției fiecărui receptor este o provocare experimentală. Am folosit o linie celulară bine caracterizată de neuroblastom (SK-N-MC) fără expresia ER transfectată stabil cu plasmidă falsă (SK-01), receptor de estrogen α (SK-ER α) sau receptor de estrogen β (SK-ER β) . ). 28, 29, 30 Aceste linii celulare ne permit să studiem funcția diferențială a ER în celulele tumorale în condiții controlate și bine descrise. 21, 28, 30, 31, 32, 33, 34 În plus, am folosit și o linie celulară de cancer de sân derivată de pacient MCF-7 ca model ER-pozitiv al cancerului de sân care exprimă endogen ERα, dar nu ERβ. Toate liniile celulare au fost caracterizate pentru exprimarea ER prin analiza PCR (Figura Adițională 1a). Așa cum s-a descris mai sus, expresia ER precum și activitatea autofagică crescută contribuie la potențialul metastatic și la rezistența la tratamentul diferitelor tipuri de cancer. 18, 35

estrogen

Receptorii de estrogen reglează diferențial expresia genelor asociate cu autofagia. ( A ) ARN-ul total din celulele SK-01, SK-ER α, SK-ER β și MCF-7 a fost caracterizat folosind Biblioteca Autofagului Primer 1 Uman (HATPL-1) și comparând celulele care exprimă ER cu controale plasmidice transfectate în mod fals ( SK-01). Numerele roșii indică o reglare mai mare de 1,5 ori, numerele albastre indică o reglare descendentă mai mare de 1,5 ori, numerele roșii închise indică valoarea P.

Am examinat în continuare dacă scăderea nivelurilor ERα în celulele MCF-7 modifică activitatea autofagică, dar ER derulat și nu a modificat semnificativ nivelul fluxului autofagic sau al expresiei BAG3. Este clar că cantitatea reziduală de expresie ERα după eliminarea RNAi este încă suficientă pentru a-și juca rolul în creșterea autofagiei necanonice (Figura Adițională 5b). Această interpretare este susținută de observații că supraexprimarea tranzitorie a ERα în celule SK-N-MC native absente de ER (precursori ai celulelor SK-01, SK-ER și și SK-ER β) duce la creșterea fluxului autofagic și la creșterea proteinei BAG3. niveluri (Figura 5b suplimentară).

Pentru a confirma că descoperirea noastră de expresie crescută a markerilor autofagici în celulele ER α reflectă creșterea biogenezei autofagosomale mai degrabă decât scăderea clearance-ului autofagomatic, am folosit un vector de expresie (ptfLC3) care codifică LC3 fuzionat cu proteina fluorescentă roșie (RFP) și proteina fluorescentă verde (GFP) în tandem (GFP-RFP-LC3). Am arătat că toate liniile celulare prezintă puncții fluorescente roșii fără un semnal corespunzător în canalul verde în condiții de control care indică fuziunea intactă a autofagozomilor cu lizozomii. În concordanță cu rezultatele Western blotting din figurile 2a și b, am observat o acumulare crescută de autofagozomi în celulele ER-pozitive (Figura 3a). Cuantificarea punctelor GFP-RFP-LC3 în fiecare linie celulară (Figura 3b) subliniază în continuare constatările noastre și demonstrează cantități semnificativ mai mari de formare de autofagolizozomi în celulele care exprimă ERα.

Inhibarea autofagiei de fază târzie de către BafA 1 duce la creșterea morții celulare în celulele care exprimă ER și la expunerea la stresul oxidativ indus de H2O2. Celulele SK-01, SK-ER și, SK-ER și MCF-7 au fost tratate cu grupul de control al vehiculului sau 400 μM și 600 μM H2O 2 cu sau fără BafA 1 (500 nM) timp de 24 de ore și moartea celulară a fost cuantificată prin citometrie în flux după colorarea iodurii de propidiu. Valorile celor trei experimente independente din fiecare panou sunt exprimate ca medie ± SEM, iar datele reprezentative din experimente sunt date în profilele graficului de dispersie FACS. (*) pe coloane reprezintă semnificația statistică P 2, 17, 21, 47 Knockdown BAG3 a fost însoțită de scăderea nivelurilor LC3-II după inhibarea lizozomală în celulele ER α-pozitive și într-o măsură mai mică în celulele SK-01, indicând faptul că reglarea descendentă BAG3 afectează semnificativ fluxul autofagic (Figurile 6a-c). Interesant este că, cu eliminarea BAG3 mediată de siARN și tratamentul cu H2O2, nu am găsit modificări ale morții celulare în celulele martor, ci o creștere semnificativă a sensibilității în celulele care exprimă ER α (Figurile 6d-f), care au fost chiar mai mari în general decât după inhibarea autofagiei prin tratamentele cu BafA 1 (Figurile 5b ad).

Efectul monitorizat al BAG3 asupra supraviețuirii celulare poate fi explicat prin rolul său în autofagie, dar se poate datora și funcțiilor sale antiapoptotice. Se consideră că acești receptori sunt reglementați de interacțiunea BAG3 cu factorul antiapoptotic BCL2, ducând la protecția celulelor împotriva morții celulelor apoptotice, 53. în timp ce BAG3 s-a dovedit, de asemenea, că atenuează proteotoxicitatea, rezultând rezistență inductibilă în celulele tumorale. Se raportează în plus că apoptoza celulelor tumorale este indusă prin reducerea la tăcere a BAG3 și îmbunătățește apoptoza celulelor neoplazice indusă de medicamente. 56, 57 S-a mai raportat că BAG3 afectează căile intense reglementate de căile proteinei de șoc termic 70 (HSP70), care sunt, de asemenea, asociate cu supraviețuirea celulelor canceroase și cu apoptoza. 58

În concordanță cu descoperirile noastre recente, rezultatele analizei proteomice au arătat rolul BAG3 și al proteinei majore a bolții ca factori de supraviețuire eficienți care contribuie la rezistența chimioterapeutică în celulele cancerului de sân. 59

Există date limitate despre biomarkeri și proteine ​​țintă care prezic în general eficacitatea inhibitorilor autofagiei în cancerul de sân. Prin urmare, este necesară disecția autofagă eficientă. Introducerea rețelelor autofagice și a „amprentelor de autofagie” individuale pentru pacienți ar putea îmbunătăți eficacitatea terapiei medicamentoase pe calea autofagică, întrucât ar putea fi utilizată o autofagie canonica dependentă de medicament versus mTOR/PI3K. Aceasta reprezintă o provocare majoră pentru dezvoltarea personalizată a medicinei și a biomarkerilor, dar și o nouă oportunitate terapeutică pentru pacienții cu cancer.

Materiale și metode

Cultură de celule

Celulele umane SK-N-MC (ATCC HTB-10) și celulele MCF-7 au fost obținute din colecția de celule de tip american și cultivate așa cum s-a descris mai sus. Toți reactivii de tratament au fost dizolvați în dimetil sulfoxid (DMSO) și utilizați la următoarele concentrații și intervale de timp: 10 nM 17β-estradiol (E2, Sigma-Aldrich, Seelze, Germania) timp de 24 de ore; 1 μM ICI 182780 (Tocris Biosciences, Bristol, Marea Britanie) timp de 24 de ore; 500 nM Bafilomycin A1 (Enzo Life Science, Farmingdale, NY, SUA) timp de 6 ore; tratament concomitent cu 1 μM Wortmannin (Sigma-Aldrich) și 100 nM bafilomicină A1 timp de 20 de ore și 50 μM U0126 (Promega, Madison, WI, SUA) timp de 48 de ore. În cazul tratamentului dublu, s-a efectuat 1 oră. Pre-tratament cu un agent inhibitor.

transfecție

Prin metoda fosfatului de calciu, celulele au fost placate în plăci cu 6 godeuri cu 24 de ore înainte de transfecție. Toți reactivii au fost reglați la temperatura camerei (RT) și 10 μg de ADN plasmidic sau 20 μg de ARNsi au fost amestecați cu 105 μl de H20 și 15 μl de CaCl2 și incubat timp de 5 minute. S-au adăugat un total de 120 pl de tampon HEPES 2x și s-au incubat timp de 30 de minute. Suspensia a fost transferată direct în mediu și după 24 de ore s-a adăugat mediu proaspăt. Plasmida GFP-RFP-LC3 (ptfLC3, Addgene, Cambridge, MA, SUA) a fost utilizată pentru a vizualiza activitatea autofagică. După alte 24 de ore, celulele au fost recoltate sau supuse imunocitochimiei. Generarea pIRES-ER α și pIRES-ER β au fost descrise mai sus 29, 30 și plasmida pIRES a fost achiziționată de la Clonetech Laboratories (Mountain View, CA, SUA).

Pentru supraexprimarea și eliminarea mediată de ARNsi, celulele au fost transfectate folosind fosfatul de calciu sau metoda FuGENE (Promega). Detaliile sunt date în informațiile suplimentare. Imensul siARN (5'-AUUCUCCGAACGUGUCACG-3 ') a fost cumpărat ca siMAX de la MWG. anti-BAG3 siARN a fost furnizat de Sigma-Aldrich (SASI_Hs02_00337266). amestecul anti-DRAM1 siARN a fost furnizat de MWG (Nr. 1: 5'-ACACCUCCAGAGAGUGGUA-3 '; Nr. 2: 5-GGAUUAUGUAUAUCACGUA-3').

Analiza Western blot

Analiza Western blot a fost efectuată așa cum s-a descris mai sus. 2 Analiza a fost efectuată cu sistemul Fusion-SL 3500 WL (Peqlab, Erlangen, Germania) și software-ul Aida Image Analyzer v.4v26 (Raytest, Straubenhardt, Germania).

imunocitochimie

Imunocitochimia celulară a fost efectuată așa cum s-a descris mai sus. 2 eșantioane de tumori încorporate în parafină au fost deparafinate și apoi rehidratate cu Xilen, urmate de o gamă descrescătoare de alcooli (100% până la 70% alcool). Rehidratarea a fost terminată prin incubare cu cel mai preferat H2O și secțiunile au fost depozitate în apă până când a fost detectat antigenul. Imunomarcarea a fost apoi efectuată așa cum s-a descris mai sus. 2 celule și țesuturi au fost analizate microscopic folosind un Leica TCS SP5 inversat (Wetzlar, Germania) și un microscop meta confocal Zeiss LSM710 (Oberkochen, Germania) și imaginile au fost procesate cu Adobe Photoshop CS5 (San Jose, CA, SUA) și Leica LAS AF (Leica Microsystems (UK) Ltd, Milton Keynes, Regatul Unit). Formarea petelor GFP-RFP-LC3 (vizualizată folosind plasmida de expresie GFP-RFP-LC3 de mai sus) a fost cuantificată prin numărarea punctelor în imagini de microscopie de scanare laser confocale corespunzătoare liniilor celulare transfectate și după tratament cu Bafilomicină A1 (500 nM, 6 h ). cel puțin 56 de celule pe linie celulară.

Microscopie electronică de transmisie

Pregătirea probelor și analiza microscopiei electronice de transmisie au fost efectuate așa cum s-a descris mai sus 63, iar imaginile au fost procesate cu Adobe Photoshop CS5.

anticorpi

Anticorpii utilizați pentru imunocitochimie, precum și pentru analiza Western blot în acest studiu au fost după cum urmează: ATG7 (8558, Cell Signaling Technologies, Danvers, MA, SUA); BAG3 (ab47124, Abcam, Cambridge, Marea Britanie); BCL2 (sc-492, Santa Cruz, Dallas, TX, SUA); ERa (RM9101S0, Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, SUA); ERK1/2 (9102, Tehnologii de semnalizare celulară); p-ERK1/2 (9106, Cell Signaling Technologies); LC3B (L7543, Sigma-Aldrich); mTOR (OP97, Millipore, Billerica, MA, SUA); p-mTOR S2448 (ab51044, Abcam); NBR1 (00004077-M01, Abnova, Taipei, Taiwan); SQSTM1 (GP62-C, Progen, Heidelberg, Germania); PI3K Clasa III (4263, Tehnologii de semnalizare celulară); Tubulin (T9026, Sigma-Aldrich); WIPI1 (HPA007493, Sigma-Aldrich); Beclinl (ab51031; Abcam); p70S6K (9202, semnalizare celulară); p70S6K Thr389 (9206, semnalizare celulară). Anticorpii secundari au fost anticorpi anti-șoarece/iepure/cobai conjugați cu DyLight 488, 649 și Cy3 (imunofluorescență, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, SUA) sau HRP (imunoblotare, Jackson ImmunoResearch).

Țesutul cancerului de sân uman

Probele de tumori de cancer de sân uman au fost obținute prin intervenții chirurgicale la pacienții cu cancer. Detalii despre pacienții cu cancer pot fi găsite în tabelul suplimentar 1. Consimțământul informat a fost obținut de la toți subiecții, iar studiile au fost aprobate de către panourile de revizuire instituțională și de Comitetul de etică al Centrului de colaborare pentru tumorile gerrante (UCT) al Universității din Frankfurt.

PCR, transcriere inversă PCR și PCR cantitativă în timp real

PCR și PCR cantitativă în timp real au fost efectuate așa cum s-a descris mai sus 21 folosind HATPL-1 (Biomol, Hamburg, Germania) conform protocolului producătorului. Prezentarea generală a modificărilor și valorile P ale genelor țintă în celulele SK-ER α, SK-ER și MCF-7 în comparație cu celulele SK-01 au fost calculate utilizând șablonul de analiză a datelor de matrice RT 2 Profiler PCR v4.0 de la Qiagen (Venlo, The Olanda)). Toate cele opt gene încărcate pe placa matricială au fost utilizate ca opt controale interne. Doar genele cu o multiplicare multiplă se modifică mai mult decât +1, 5 sau -1, 5 și o valoare P de P 64). Transfecția a fost efectuată așa cum s-a descris mai sus. După 24 h celulele au fost stimulate cu 17 β-estradiol (10 nM) și/sau ICI (1 μM) timp de 24 h. Ulterior, celulele au fost recoltate utilizând sistemul de testare a luciferazei (Promega, nr. De cat. E4030). Concentrațiile de proteine ​​au fost determinate de BCA așa cum s-a descris mai sus și citirile de luminiscență au fost atribuite într-un contor automat (Wallac Victor2, PerkinElmer, Waltham, MA, SUA). Experimentele de transfecție au fost efectuate în triplicate, repetate de trei ori și normalizate pentru proteine ​​identice.

Experimente de supraviețuire prin sortare de celule activate cu fluorescență (FACS)

Douăzeci și patru de ore înainte de stimulare, celulele SK-01, SK-ER α, SK-ER β și MCF-7 au fost însămânțate în plăci cu 24 de godeuri. După 1 h de pre-incubație cu Bafilomycin A 1 (500 nM) sau DMSO, celulele au fost tratate cu control vehicul, 400 μ M sau 600 μ M H 2 O 2 (Sigma-Aldrich) timp de 24 de ore. După tratament, supernatantul din celule a fost colectat și celulele au fost dizolvate din plăci cu digestie cu tripsină și din nou incubate cu supernatantul colectat anterior. După 5 minute de centrifugare (800 g) celulele au fost rezolvate în 100 μl PBS. Toți pașii au fost efectuați pe gheață. Viabilitatea celulară a fost măsurată prin colorarea celulelor cu iodură de propidiu (PI) (1 μ g/ml). Fluorescența PI a fost determinată cu un citometru de flux FACScan (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, SUA). Populațiile de celule au fost predate prin împrăștiere înainte (FSC-Înălțime) și dispersie laterală (SSC-Înălțime). Ulterior, rezultatele au fost analizate cu software-ul BD CellQuest Pro Analysis.

analize statistice

Datele cantitative sunt exprimate ca medii ± SEM Comparații statistice între grupurile experimentale au fost făcute folosind testul t Student. Valorile probabilității lui P ≤0,05 au fost considerate semnificative.