abstract

Înmulțirea, dispersarea și așezarea sunt procese populare de bază și sunt etape critice în ciclul de viață al unui organism. În organismele simbiotice, cum ar fi lichenii, constând din ciuperci și populații fotobionți, reproducerea este un proces complex. Deși mulți licheni sunt capabili să se reproducă atât sexual cât și asexual, nu se cunoaște amploarea reproducerii vegetative la populațiile locale. Am folosit șase loci polimorfi microsateliți pentru a determina dacă recombinarea este comună în populațiile naturale și dacă și cum reproducerea clonală afectează structura genetică spațială în populațiile de licheni epifite din Lobaria pulmonaria. Diversitatea genetică ridicată în toate cele 12 populații studiate și dovezi ale recombinării, din diferite teste, au arătat că L. pulmonaria este predominant străbătătoare de specii. Cu toate acestea, clonalitatea a apărut la toate populațiile, dar prezența genotipurilor repetitive multilock a afectat structura genetică spațială doar la populațiile cu densitate mică. Acest lucru ar putea fi interpretat ca un indicator al blocajelor genetice cauzate de pierderea crescută a habitatului și perturbarea acestuia. Ca urmare, pentru speciile care traversează predominant licheni, factorii exogeni ar putea afecta semnificativ procesele populației și, astfel, structura genetică.

Promovarea, fie ea sexuală sau asexuată, este un pas fundamental în ciclul de viață al fiecărui organism individual. Reproducerea sexuală crește numărul de genotipuri diferite în populații și crește probabilitatea de supraviețuire într-un mediu competitiv și/sau în schimbare (Maynard Smith, 1978; Balloux și colab., 2000), în timp ce răspândirea asexuată poate fi o strategie de dezvoltare de succes pentru genotipuri adaptate în habitate extreme, dar stabile (Murtagh și colab., 2000). În timp ce cunoștințele noastre despre sistemele și modelele de împerechere la animale și plante sunt extinse (de exemplu, Jackson și colab., 1996; Takebayashi și Morrell, 2001), am început doar să le studiem și să le înțelegem în forme de viață simbiotice precum licheni. În ciuda mai multor studii privind reproducerea sexuală în licheni (Murtagh și colab., 2000; Kroken și Taylor, 2001; Högberg și colab., 2002), nu se știe nimic despre semnificația sa în comparație cu reproducerea clonală (prin fragmente de talus, soredia sau isidie) în populațiile naturale. Obiectivele acestui studiu au fost, prin urmare, (i) de a investiga dacă recombinarea și, prin urmare, extragerea, este comună în populațiile de licheni naturali și (ii) de a determina modul în care reproducerea clonală afectează structura genetică spațială a populațiilor.

Materiale și metode

Folios lichen epifitic L. pulmonaria (L.) Hoffm. este larg distribuit în zonele înconjurătoare ale emisferei nordice și în Africa de Sud (Yoshimura, 1971, 1998a, 1998b). În timp ce L. pulmonaria este răspândită și încă obișnuită în America de Nord (Brodo și colab., 2001), este considerată pe cale de dispariție în multe părți ale Europei (Wirth și colab., 1996). Deși este descrisă ca o specie cu propagare sexuală și clonală, apocas (corpuri de fructe cu propagule sexuale) se formează adesea și populațiile cu un număr limitat de genotipuri fungice apar non-sexuale (Zoller et al, 1999). Această corelație între diversitatea genotipică și fertilitate a fost interpretată ca dovadă că L. pulmonaria poate fi auto-sterilă (heterotalică; Zoller și colab., 1999).

Prelevarea de probe

Un total de 562 talc de L. pulmonaria au fost colectate de la nouă populații din Columbia Britanică, Canada și trei populații din Elveția (Tabelul 1). Am considerat că populația este un petic de copaci colonizați cu L. pulmonaria. În spatele perimetrului peticului, această specie nu era prezentă local. Probele din Columbia Britanică au fost colectate în trei zone diferite (timp hypermari, naval și intermontan; Goward, 1999) pentru a migra de pe coasta de sud a insulei Vancouver către interiorul provinciei. Aceste populații au apărut fie în păduri vechi (de exemplu, CS, PR, DC, CL, BL sau OC), fie în păduri dense neperturbate (AY, TO și BC). Probele din Elveția au fost colectate în populații relativ mari, dar slab populate, în Prealpi și Munții Jura, unde perturbarea antropogenă a fost minimă. În întreaga populație, un taliu per copac a fost preluat aleatoriu din arborii învecinați cei mai apropiați selectați. S-a măsurat distanța dintre copacii gazdă, s-a calculat aria populației locale (Tabelul 2) și s-a determinat numărul de probe cu apotecii.

Tabel în dimensiune completă

Tabel în dimensiune completă

Analiza microsatelitelor

ADN-ul a fost izolat conform lui Walser și colab. (2003) din aproximativ 20 mg de lobi marginali purificați pe talus. Au fost studiate șase loci de microsatelite (LPu03, LPu09, LPu15, LPu16, LPu20 și LPu27; Walser și colab., 2003) și patru dintre grundurile originale au fost reproiectate pentru a scurta dimensiunile alelelor sau pentru a evita indels în regiunile flancante. (Tabelul 3). Site-urile au fost amplificate în două reacții în lanț polimerază multiplex (PCR), fiecare conținând trei perechi de primer (LPu03/LPu09/LPu15 și LPu16/LPu20/LPu27). Amplificarea ulterioară și analiza fragmentelor folosind un secvențial capilar automatizat au urmat protocoalele lui Walser și colab. (2003). Deoarece ADN-ul a fost izolat din materialul tallus, proporția de ADN fungic nu a fost cunoscută și a variat între probe. S-au folosit 3 pl de extract de ADN genomic în fiecare reacție de amplificare de 30 pl. Pe lângă Walser și colab. (2003), lungimile a 19 alele din locusul LPu09, care au fost mai lungi de 400 bp, au fost parțial verificate cu dimensiunea standardului ROX-1000 (Applied Biosystems) și ulterior extrapolate. Probele cu date lipsă de microsateliți au fost excluse (n = 3).

Tabel în dimensiune completă

analize statistice

Numărul mediu de alele (A) și numărul mediu de alele efective (Ae) au fost calculate conform lui Hartl și Clark (1997).

Deoarece partenerul fungic lichen este haploid și are o singură alelă pe locus, testele de recombinare implică examinarea asocierilor alelice între diferiți loci (Maynard Smith și colab., 1993). Panmixia ar însemna că alelele de la toate locurile, cu excepția locurilor apropiate fizic, au fost legate la întâmplare între ele. Cu toate acestea, chiar și genele de pe diferiți cromozomi se pot abate de la asocierea aleatorie datorită diferiților factori, cum ar fi derivarea genetică, selecția, reproducerea clonală și/sau împerecherea inadecvată (Lewontin, 1988). Am folosit testul χ 2 cu valori P calculate prin permutări de Monte Carlo cu 10.000 de replici și modificate prin metoda Hommel pentru comparații multiple (Hommel, 1988) pentru a testa prezența unei asocieri semnificative între perechi de loci pe populație ( cu a. Fără a repeta genotipurile). De asemenea, am calculat măsura normalizată a dezechilibrului total descrisă de Hedrick (1987) și testul de probabilitate al probabilității Fisher extins sub ipoteza nulă că nu există nicio asociere între cei doi loci testați pe populație, așa cum a fost implementat în ARLEQUIN (Schneider și colab., 2000).

De asemenea, am folosit un indice de asociere standardizat (IA) (Maynard Smith și colab., 1993) pentru a controla recombinarea sau clonalitatea în populații. Din distribuția valorilor de nepotrivire, abaterea observată (VD) a fost calculată și comparată cu abaterea așteptată (Ve) sub legarea de echilibru (Maynard Smith și colab., 1993; Haubold și colab., 1998; Haubold și Hudson, 2000). Ipoteza nulă (I A = 0, adică asocierea aleatorie a alelelor) a fost testată prin 1000 permutări și valorile P au fost din nou ajustate prin metoda Hommel (1988). Aceste calcule au fost efectuate o dată și o dată fără genotipuri repetitive.

Dacă ciuperca care formează lichenul este reprodusă clonal (prin mitoză) sau prin împerechere homotalică, întregul genom este legat în mod eficient, deoarece nu există segregare și nu există o sortare a alelelor. În plus, am calculat comparații în perechi ale locurilor microsatelite în plus față de asociațiile multilocus descrise mai sus. Lipsa asocierii între orice pereche de loci poate fi interpretată ca o consecință a recombinării, în timp ce legarea sau homoplazia pot provoca abateri de la frecvențele genotipice așteptate în împerecherea aleatorie la unele perechi de locus.

Structura genetică spațială a populațiilor a fost analizată pe baza genotipurilor multilocus (Smouse și Peakall, 1999) folosind GENALEX (Peakall și Smouse, 2001) pentru a investiga efectele de împrăștiere ale propagulelor vegetative și sexuale. Am efectuat un test de autocorelație spațială pentru o clasă de distanțe cu aceleași dimensiuni ale eșantionului și am folosit un model de mutație secvențială bazat pe diferențele dintre cele două genotipuri (Slatkin, 1995), care se bazează pe diferențele de sumă dintre cele două genotipuri (Slatkin, 1995 ). Analiza autocorelației spațiale a fost efectuată de două ori: o dată și o dată fără genotipuri repetitive. Abaterea de la ipoteza nulă H 0: r = 0 a fost determinată de 1000 permutări. În plus față de această analiză, am testat și corelația dintre distanțele geografice și genetice la populațiile de L. pulmonaria folosind teste Mantel cu 1000 permutări calculate cu pachetul R.

Coeficienții de corelație ai corelației Spearman au fost folosiți pentru a estima asocierea dintre zona populației locale (transformată în log) și procentul diferitelor genotipuri (M) sau probe fertile și între procentul probelor fertile și numărul mediu de alele (A) sau efectiv mediu numărul alelei (Ae).

Rezultatul

Diversitatea microsateliților și frecvența apoteciei

Diversitatea genetică în populațiile locale de L. pulmonaria, bazată pe șase loci microsatelite, a fost ridicată. Dintre cei 562 de indivizi analizați, am găsit 405 de genotipuri diferite, dintre care 75% au apărut o singură dată. Numărul de alele pe locus și populație a variat de la unul pentru locusul LPu27 din populația DC la 22 pentru locusul LPu20 din populația BC. Numărul mediu de alele pe populație (A) a variat de la 5, 3 la 10, 5, iar numărul efectiv mediu de alele (Ae) a variat de la 3, 1 la 5, 7 (Tabelul 2). Procentele diferitelor genotipuri (M) au fost uniform reduse la populațiile elvețiene (

50%), dar a variat între 52 și 92% în rândul populațiilor din Columbia Britanică (Tabelul 2). Procentele de probe fertile (purtând apotecii) au variat de la 0% (populație cu ultrasunete) la maximum 42% (populații CS și PR; Tabelul 2). A existat o asociere negativă semnificativă între M și populația locală (coeficientul Spearman, r s =, 0, 766, P = 0,005). În schimb, nu am găsit o corelație semnificativă între procentul de probe fertile (apotecii) și numărul mediu de alele (A) sau numărul efectiv mediu de alele (A e) sau între procentul de probe fertile și populația locală.

Recombinarea și clonalitatea

Toate cele trei măsurători de legare a dezechilibrului, testul χ2, măsurarea normalizată a lui Hedrick a dezechilibrului total și testul de probabilitate extinsă al probabilității Fisher au dat rezultate similare. Sunt date doar rezultatele testului χ 2 (Tabelul 4). Aproximativ 5% din toate comparațiile perechi din Columbia Britanică și 7% din Elveția au respins ipoteza nulă a independenței locusului. Rezultatele nu au fost în concordanță cu loci și au sugerat un dezechilibru obligatoriu între locurile LPu 16/LPu 27 și LPu 20/LPu 27 (Tabelul 4).

Tabel în dimensiune completă

În analiza IA a asocierii și a indexului de asociere multiloc (Maynard Smith și colab., 1993) și când au fost luate în considerare toate eșantioanele, ipoteza nulă (adică nicio asociere între cei doi loci) a fost respinsă în 32 și 69% din toate comparațiile perechi din Populațiile Columbia Britanică și Elveția (Tabelul 5a). Excluzând genotipurile repetitive, ipoteza nulă a fost respinsă în comparații perechi de doar 5% pentru Columbia Britanică și 4% pentru Elveția (Tabelul 5b). În conformitate cu analiza de mai sus a legăturilor de neechilibru, valoarea ușor mai mare a valorilor IA a fost semnificativ diferită de zero pentru loci LPu 16, LPu 20 și LPu 27 (Tabelul 5b).

Tabel în dimensiune completă

Structura genetică spațială

Analiza autocorelației spațiale a arătat diferite structuri genetice la populațiile L. pulmonaria din Elveția și British Columbia. La populațiile elvețiene, valorile pozitive de autocorelație (r) au fost găsite în primele clase la distanță atunci când toate probele (cu genotipuri repetitive) au fost utilizate în analiză (Figura 1). În populația MT, un coeficient deosebit de ridicat r> 0,6 a fost găsit la cea mai mică distanță. Cu toate acestea, această autocorelație pozitivă la populațiile elvețiene a dispărut atunci când genotipurile recurente au fost excluse din analiză (Figura 1). În schimb, nu am găsit nicio structură genetică semnificativă în niciuna dintre cele nouă populații de L. pulmonaria din Columbia Britanică, indiferent dacă au fost sau nu luate în considerare genotipurile recurente. De exemplu, corlogramele corespunzătoare pentru populația TO sunt prezentate în FIG.

clonală

Exemple de autocorelație spațială multilocală în Lobaria pulmonaria; populații din Elveția (TW, MT și UZ) și Columbia Britanică în Canada (TO). Două corelograme cu și fără genotipuri repetitive sunt prezentate pentru fiecare populație. Intervalele de încredere de 95% sunt indicate prin linii punctate și valorile semnificativ diferite de zero (pe baza a 1000 permutări) sunt indicate printr-un asterisc. Rețineți diferitele scale ale axei x în raport cu aceeași dimensiune a eșantionului în clasele de distanță, dar, prin urmare, scale diferite pe populație.

Imagine la dimensiune completă

În concordanță cu aceste rezultate, corelațiile Mantel semnificative și pozitive au fost găsite numai între distanțele geografice și genetice ale populațiilor elvețiene atunci când au fost incluse toate probele (datele nu sunt prezentate). Cu toate acestea, corelațiile nu au fost semnificative atunci când a fost utilizat un set de date redus fără genotipuri repetitive.

discuţie

recombinare

În general, populațiile din Elveția aveau densități mai mici de talii decât populațiile din Columbia Britanică și puteau reprezenta rămășițele populațiilor mai mari, mai dense și mai fertile. În plus, relația dintre probele fertile și gradul de diversitate genetică este influențată de ciclul de viață al lichenilor pe tot parcursul anului și de faptul că apotecii din L. pulmonaria apar în etapele ulterioare ale vieții (Ramstad și Hestmark, 2001; Denison, 2003 ). Prin urmare, este posibil ca diferite structuri de vârstă în cadrul populațiilor studiate să ducă la diferențe în frecvența observată a apoteciei. Cu toate acestea, datele din Tabelul 2 sugerează că procentul de probe fertile pe populație poate varia între Elveția și Columbia Britanică sau chiar între zonele din Columbia Britanică. Aceste descoperiri sugerează că frecvența și dezvoltarea apoteciei sunt guvernate de factori exogeni, cum ar fi oceanul, care, totuși, este confundat în studiul nostru de înălțimea.

Structura genetică

Un studiu recent al letargiei vulpinei a arătat că eșantioanele din America de Nord au avut o variație genetică mai mare la opt situri polimorfe nucleotidice (SNP) decât eșantioanele din Suedia sau Italia. Prin urmare, s-a ajuns la concluzia că L. vulpina ar trebui tăiată în America de Nord, dar efectiv clonală în Europa (Högberg și colab., 2002). În mod similar, datele noastre sugerează că populațiile L. pulmonaria din British Columbia au, de asemenea, semnificativ mai multe genotipuri decât populațiile elvețiene (Tabelul 2). Această diversitate genotipică mai mică în populațiile elvețiene poate fi atribuită blocajelor istorice (Zoller și colab., 1999). În plus, am constatat, de asemenea, că populațiile din Insula Vancouver, cu excepția populației CL, aveau o diversitate genotipică mai mică decât populațiile continentale. Acest lucru s-ar putea datora izolării spațiale a acestor populații (Walser și colab., Date nepublicate). Interesant este faptul că numărul de genotipuri diferite a arătat o relație negativă cu populația locală, ceea ce poate indica faptul că populațiile mai dense susțin un număr mai mare de genotipuri.

În plus, datele noastre indică o răspândire clonală substanțială pe scară mică în cele trei populații elvețiene (Walser, în presă). Diferitele structuri genetice spațiale dintre populațiile de pe două continente pot fi atribuite densității populației și istoriei. De exemplu, populațiile din Columbia Britanică apar în ecosisteme forestiere mai puțin perturbate în comparație cu populațiile elvețiene, care ar fi putut duce la densități locale mai mari, generații suprapuse și un număr mai mare de genotipuri diferite, chiar și într-o zonă mică. Interesant este că Gu et al. (2001) au descoperit că modelele spațiale ale L. pulmonaria în Finlanda erau mai controlate decât în ​​pădurile virgine. Deși nu au examinat structura genetică spațială, rezultatele lor, împreună cu rezultatele noastre, sugerează că istoria populației poate influența tiparele spațiale dintr-o populație.

concluzii

Mulțumiri

Mulțumim lui Trevor Goward și Andy MacKinnon pentru cazare, discuții pline de viață și asistență pe teren. De asemenea, suntem recunoscători lui Phil LePage, David Cuzner și Trace Leys-Schirok de la British Columbia Forest Service pentru sprijinul acordat. Suntem datori lui Susan E Hoebee, doi recenzori și un editor pentru comentariile lor constructive asupra manuscrisului. Această cercetare a fost finanțată de Fundația Națională Științifică Elvețiană (SNF 31-59241.99) și este legată de Programul NCCR de Supraviețuire a Plantelor, PS6.