obiecte
abstract
Pentru a investiga mecanismul de epuizare a lipidelor de către zinc-α2-glicoproteină (ZAG).
proiecta:
Studiile au fost efectuate la șoareci ob/ob sau pe adipocite izolate de la aceste animale sau omologii lor săraci.
rezultatele:
concluzie:
Aceste rezultate sugerează că ZAG nu numai că induce lipoliza directă, dar sensibilizează și țesutul adipos la alți stimuli lipolitici.
Obezitatea și consecințele sale asupra sănătății sunt o problemă majoră pentru lumea occidentală și se crede că apar atât prin influențe genetice, cât și de mediu. Obezitatea este asociată cu rezistența la insulină și diabetul de tip 2 prin eliberarea de acizi grași neesterificați și citokine pro-inflamatorii din adipocite. Abordarea actuală a managementului implică schimbarea stilului de viață combinată cu intervenția farmacologică, deși opțiunile de tratament sunt limitate.
S-a demonstrat că ZAG induce pierderea țesutului adipos printr-un efect lipolitic asupra WAT, combinat cu o expresie crescută a decuplării proteinei-1 în BAT, ceea ce ar duce la creșterea cheltuielilor de energie. 3, 15 Efectul lipolitic apare din activarea adenilil ciclazei pentru a forma AMP ciclic într-un proces dependent de guanozin trifosfat 4, care este atenuat de antagonistul specific p3-AR SR59230A, 16, sugerând că este mediat de p3-AR. Folosind șoareci ob/ob ca model experimental, acest studiu evaluează efectul ZAG asupra enzimelor lipolitice și sensibilitatea adipocitelor la stimulii lipolitici.
Materiale și metode
materiale
Șoarecii hiperglicemici obezi (ob/ob) (73-77 g; Tabelul 1) au fost găzduiți în propria colonie. Originea și caracteristicile acestor animale au fost descrise în detaliu anterior. Exprimarea genei ob în acest context produce o formă mai severă de diabet decât șoarecii ob/ob C/BL/6J. Șoarecii au fost adăpostiți într-o cameră cu aer condiționat la 22 ± 2 ° C și au fost hrăniți ad libitum, șobolani și șoareci de șobolan (Special Diet Services, Witham, Marea Britanie) și apă de la robinet. Șoarecii masculi (cu vârsta cuprinsă între 20 și 21 de săptămâni) au fost împărțiți în trei pe cușcă și li s-a administrat ZAG (35, 50 sau 100 μg pe zi) prin administrare intravenoasă (n = 6) sau soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) (n = 6). Greutatea corporală și aportul de alimente și apă, precum și temperatura corpului, au fost monitorizate zilnic folosind un termometru rectal (RS Components, Northants, UK) și s-a măsurat, de asemenea, debitul de glucoză în urină.
Tabel în dimensiune completă
Determinarea compoziției corpului
Compoziția corpului a fost determinată gravimetric așa cum s-a descris mai sus. 3 Pe scurt, la finalizare, animalele au fost încălzite la 80-90 ° C până la atingerea unei greutăți constante, iar conținutul de apă a fost determinat din diferența dintre greutatea umedă și cea uscată. Lipidele au fost extrase din carcasa uscată prin extracție cu cloroform/metanol (1: 1), etanol/acetonă (1: 1) și dietil eter; solvenții au fost combinați și evaporați. Greutatea reziduului a dat grăsimea totală din carcase și greutatea masei negrase din carcase a fost calculată ca diferență între greutatea inițială a carcasei și greutatea apei și a grăsimilor.
Producerea și purificarea ZAG uman recombinant
Celulele HEK 293F umane au fost transfectate cu un vector de expresie a celulelor mamifere pcDNA 3.1 conținând ZAG uman și selectate pentru creștere în neomicină (50 ug ml-1) în mediu Freestyle într-o atmosferă de 5% CO 2 în aer la 37 ° C. Nivelurile de proteine în mediul de cultură a crescut treptat cu timpul până la nivelul platoului în aproximativ 2 săptămâni după inoculare. Celulele au fost îndepărtate prin centrifugare la 700 g timp de 15 minute și mediul (200 ml) a fost concentrat la un volum de 1 ml de PBS steril folosind un filtru centrifugal Amicon Ultra-15 de 10 kDa (Millipore, Watford, Middlesex, Marea Britanie). Concentratul (conținând aproximativ 2 mg de proteină) a fost apoi adăugat la dietilaminoetilceluloză (2 g) suspendat în 20 ml de 10 mM Tris, pH 8,8 și agitat la 4 ° C timp de 2 ore. ZAG se leagă de dietilaminoetilceluloză celuloză, care este sedimentată prin centrifugare (1500 g timp de 15 minute) și eluată prin agitare timp de 30 minute la 4 ° C cu 20 ml de 10 mM Tris, pH 8,8, conținând 0,3 M NaCI. După sedimentare, lichidul supernatant care conține ZAG a fost concentrat la un volum de 1 ml în PBS steril folosind un filtru centrifugal Amicon. ZAG a fost lipsit de endotoxină, așa cum a fost determinat de setul de test unic LAL Pyrogent (Lonza). Puritatea ZAG recombinantă a fost> 95% așa cum s-a descris mai sus. 15
Pregătirea adipocitelor umane și șoarecilor
Țesutul adipos a fost tocat în fragmente mici și digerat în bicarbonat Krebs-Ringer conținând 1 g de 1-1 colagenază și 4% albumină serică bovină sub 95% oxigen/5% CO 2 la 37 ° C așa cum este descris. După 30 de minute, adipocitele au fost filtrate printr-o plasă de nailon (dimensiunea porilor 250 μm), centrifugate la 500 g timp de 2 minute și spălate de trei ori cu PBS înainte de suspensie în mediu RMPI 1640 conținând 10% ser fetal de vițel și menținute în atmosferă . 5% CO2 în aer la 37 ° C. Mediul de cultură a fost înlocuit zilnic. Numărul de adipocite a fost determinat cu un hemocitometru.
Test lipolitic
Pentru testele lipolitice, 105 până la 2 x 105 adipocite au fost incubate cu reactiv lipolitic timp de 2 ore în 1 ml de tampon bicarbonat Krebs-Ringer, pH 7, 2, iar extinderea lipolizei a fost determinată prin măsurarea eliberării glicerolului, exprimată ca μmol glicerol pe litru. 105 adipocite în 2 ore. 19 probe martor care conțin adipocite singure au fost analizate pentru a determina eliberarea spontană de glicerol.
Lipoliza in vivo prin injectarea directă a indicatorului în tampoane de grăsime
Analiza Western blot
WAT proaspăt excizat a fost spălat în PBS și lizat în reactiv de extracție fosfosafă timp de 5 minute la temperatura camerei, urmat de sonicare la 4 ° C. Probele de proteine citosolice generate prin centrifugare la 18.000 g timp de 5 minute la 4 ° C au fost separate pe 12% SDS -electroforeza pe gel de poliacrilamidă la 180 V timp de aproximativ 1 oră și transferată la membrane de nitroceluloză de 0,45 μm, care au fost blocate cu 5%. Trăiește în soluție salină tamponată cu Tris, pH 7,5, la 4 ° C peste noapte. Atât anticorpii primari, cât și cei secundari au fost folosiți la o diluție de 1: 1000. Incubația a fost timp de 1 oră la temperatura camerei și dezvoltarea a fost îmbunătățită prin chemiluminescență. Bloturile au fost scanate cu un densitometru pentru a cuantifica diferențele.
analize statistice
Rezultatele sunt raportate ca medie ± sem pentru cel puțin trei experimente replicate. Diferențele în compozițiile dintre grupuri au fost determinate de analiza unică a varianței, urmată de mai multe teste de comparație Tukey-Kramer. Valorile P 23, care indică rolul căii ERK în inducerea sa. Rezultate similare au fost obținute pentru expresia proteinei ATGL, care a fost dublată atât de ZAG, cât și de izoproterenol, iar acest lucru a fost complet atenuat de PD98059 (Figura 1e), indicând din nou un rol pentru ERK. Lipoliza indusă în adipocite ZAG izolate și într-o măsură mai mică de izoproterenol a fost atenuată de PD98059, deși nu a revenit la valorile bazale (Figura 1f). Aceste rezultate sugerează că calea ERK este implicată în expresia crescută a proteinelor HSL și ATGL în WAT. 24, 25 
Activitatea lipolitică a ZAG în adipocite izolate de la șoareci slabi și ob/ob, adipocite umane și efectul ZAG asupra expresiei HSL. A ) Inducerea lipolizei în adipocite epididimale de șoarece din slab (▪) și ob/ob ( □ ) șoareci cu izoproterenol sau ZAG la concentrațiile indicate timp de 2 ore. Diferențele față de animalele slabe sunt raportate ca * P ** P *** P) comparativ cu nivelurile bazale (▪). Diferențe față de adipocitele epididimale în ( A ) sunt raportate ca ** P ** P *** P *** P † P †† P 15 Creșterea greutății corporale a fost văzută ca o creștere a greutății musculare gastrocnemius, deși nu a existat niciun efect asupra greutății musculare solei. BAT a fost aproape dublată (PBS 0,42 ± 0,12 g, ZAG 0,79 ± 0,66 g; nivelurile de glucoză plasmatică și insulină P15 au fost reduse, la fel ca și nivelurile de acid gras neesterificat și trigliceride, în timp ce nivelurile de glicerol au fost reduse). similar cu cel din 5 zile după administrarea ZAG, iar excreția urinară de glucoză a fost, de asemenea, redusă (Figura 2c), dar scăderea principală a avut loc în primele 5 zile după administrarea ZAG, după care nivelurile au rămas constante.
Efectul ZAG asupra greutății corporale, temperaturii și excreției urinare de glucoză la șoarecii ob/ob. A ) Efectul ZAG (100 μg; intravenos, ▪) sau PBS (♦) asupra greutății corporale a șoarecilor ob/ob pe parcursul a 15 zile. Zilele în care ZAG nu a fost administrat sunt marcate ↑. ( b ) Temperatura rectală a șoarecilor ob/ob tratați cu PBS (♦) sau ZAG (▪) așa cum este descris în ( A ). ( c ) Excreția urinară a șoarecilor ob/ob administrați cu PBS (♦) sau ZAG (▪) timp de 15 zile. Diferențele față de controalele PBS sunt raportate ca * P
Expresia HSL și răspunsul lipolitic al adipocitelor de la șoareci ob/ob administrat ZAG. ( A ) Western blot prezintă expresia ZAG în țesutul adipos epididimal (ep), subcutanat (sc) și visceral (vis) al șoarecilor ob/ob după 5 zile de administrare continuă de ZAG (35 μg; intravenos pe zi). Actina a servit drept control al sarcinii. ( b Adipocitele (ep) au fost îndepărtate de la șoareci la sfârșitul a 5 zile de tratament (ziua 0) și menținute în mediu RPMI 1640 conținând 10% ser fetal de vițel în absența ZAG pentru încă 4 zile. Expresia ZAG a fost determinată prin Western blot. ( c ) Western blot prezintă expresia fosfo HSL în adipocite ep direct după îndepărtarea de la șoareci (ziua 0) și după alte 4 zile în cultură tisulară în absența ZAG. ( d ) Răspuns lipolitic al adipocitelor ep in vitro la șoareci ob/ob tratați cu PBS (▪) sau ZAG (in vitro).
Exprimarea proteinelor HSL, ATGL și fosfo ERK la șoareci WAT ob/ob tratați cu ZAG. Western blots care arată expresia HSL ( A ), ATGL ( b ) și fosfo ERK ( c ) în adipocite epididimale (ep), subcutanate (sc) și viscerale (vis) îndepărtate de la șoareci ob/ob tratați fie cu PBS, fie cu ZAG (35). intravenos) timp de 5 zile. Analiza densitometrică reprezintă media a trei pete separate. Diferențele față de animalele tratate cu PBS sunt raportate ca * P
Rata pierderii radioactivității din epididim ( A ) [U-14C] epididimal marcat cu palmitat, ( b ) subcutanat, c ) tampoane de grăsime mezenterice (viscerale) ale șoarecilor ob/ob după tratament cu fie ZAG (50 μg; intravenos); iv) zilnic) (▪) sau PBS (♦) timp de 5 zile. ( d ) acumularea de palmitat [U-14C] în diferite organe la 1 oră după injectarea directă în tampoanele de grăsime epididimale ale șoarecilor ob/ob după administrarea oricărui ZAG (50 μg; iv pe zi) ( □ ) sau PBS (▪). Diferențele față de controalele PBS sunt raportate ca * P ** P 14 C] palmitic din depozitele de grăsime epididimale s-ar corela și cu un răspuns lipolitic crescut la ZAG (Figura 1a) comparativ cu adipocitele subcutanate și viscerale (Figura 1b). Acest efect este observat și cu agonistul β3-AR, BRL 37344 (Figura 6a), care a determinat stimularea crescută a lipolizei la adipocitele epididimale de la animalele tratate cu ZAG, în timp ce în adipocitele subcutanate și viscere, pretratamentul cu ZAG nu a avut niciun efect asupra lipoliticului raspuns. Aceste rezultate sugerează că ZAG poate acționa sinergic cu agoniștii β3-AR pentru a mobiliza lipidele. Sensibilizarea adipocitelor la BRL 37344 a fost observată și în cultura pe termen scurt după 2 ore de incubație cu ZAG, dar nu cu izoproterenol (Figura 6b).
HSL a fost inițial considerat a fi o enzimă care limitează rata, dar datele recente 35 sugerează că ATGL poate fi un factor limitativ. La fel ca în cazul HSL, 13 niveluri de ATGL în țesutul adipos subcutanat al persoanelor obeze s-au dovedit a fi reduse, în ciuda expresiei crescute a ARNm36, deși alte studii 37, 38 au raportat o scădere atât a ARNm HSL cât și ATGL și a proteinelor. Există o corelație semnificativă între expresia mRNA ATGL și HSL atât în țesuturile adipoase viscerale, cât și în cele subcutanate, sugerând un mecanism de reglare comun pentru exprimarea lor. 37, 38 Acest lucru poate fi legat de activarea căii ERK, așa cum sa raportat în studiile in vitro, deoarece ERK a fost activat în toate depozitele de țesut adipos după administrarea ZAG la șoareci ob/ob. S-a demonstrat că atât rezistența la insulină, cât și hiperinsulinemia la indivizii obezi se corelează cu expresia proteinelor ATGL și HSL, independent de masa grasă. Astfel, capacitatea ZAG de a crește atât expresia HSL cât și ATGL s-ar corela cu capacitatea sa de a atenua rezistența la insulină15, deși alte mecanisme, precum absorbția crescută și oxidarea glucozei și a acizilor grași, sunt probabil mai importante.
Tratamentul șoarecilor ob/ob ZAG a crescut, de asemenea, expresia proteinei ZAG în țesutul adipos epididimal, subcutanat și visceral. Deși expresia ZAG este scăzută în obezitate, 7, 8, 9, s-a demonstrat că expresia sa în WAT a crescut de 10 ori la șoarecii cașexie. Acest lucru s-a dovedit a fi datorat unei creșteri a cortizolului seric 39, deși s-a demonstrat că factorul de necroză a tumorii-factorul necrozant α duce la o scădere de 4 ori a expresiei ZAG în sindromul Simpson-Golabi-Behmel 40 adipocite umane, oferind o mecanism potențial pentru a explica niveluri scăzute.ZAG găsit în țesutul adipos al subiecților obezi. Inducerea ZAG în adipocite 3T3-L1 prin administrarea de ZAG exogen s-a dovedit a fi atenuată de antagonistul selectiv β3-AR SR59230A, sugerând că este mediat de β3-AR. 39
ZAG poate fi necesar pentru un efect optim p3-AR deoarece șoarecii knockout ZAG au prezentat un răspuns mai scăzut la agonistul specific β3-AR CL316243. Deoarece nivelurile ZAG sunt scăzute în obezitate, expresia 7, 8, 9, p3-AR poate fi, de asemenea, suboptimă. Astfel, agoniștii p3-AR pot necesita o activitate ZAG optimă, dovadă fiind efectul lipolitic sporit al izoprenalinei și al BRL 37344 în adipocite de la șoareci ob/ob tratați cu ZAG. În plus, multe dintre efectele ZAG asupra diabetului în acest model 15 sunt probabil legate de activitatea sa agonistă 3-AR. Agoniștii 16p3-AR induc lipoliza în WAT, prin calea clasică AMP ciclică și protein kinază A, și prin calea ERK, care reprezintă 15-25% din lipoliza totală. 32
Adipocitele de la șoareci obezi exprimă, de asemenea, niveluri de două ori mai scăzute ale Gamma, o subunitate stimulatoare a proteinei de legare a guanozinei trifosfat care stimulează adenilil ciclaza. S-a demonstrat că ZAG crește expresia Gαs și scade expresia proteinei G inhibitoare, Gαi, în adipocite 3T3, 43 sugerând un mecanism prin care ZAG poate spori răspunsul lipolitic în plus față de inducerea HSL și ATGL.
Aceste rezultate indică faptul că ZAG a cauzat o reducere semnificativă a masei grase la șoarecii ob/ob. Efectul s-a manifestat prin activitate lipolitică împreună cu inducerea expresiei proteinelor HSL și ATGL în adipocite, care ar provoca sensibilizare la alți stimuli lipolitici. În plus, lipidele eliberate vor fi convertite în căldură prin greutatea BAT crescută. Aceste rezultate sugerează că ZAG poate depăși unele dintre modificările metabolice asociate cu starea obeză. Alte studii vor investiga rolul receptorilor β-adrenergici în acțiunea ZAG.