obiecte

abstract

lspr

Scanare moleculară nanoplasmonică în canale microfluidice. ( A ) Legarea nespecifică va epuiza atât receptorul, cât și concentrația moleculară țintă dacă canalul nu a fost pasivat, ducând la un răspuns întârziat al senzorului și la un consum ridicat de receptor și țintă. Săgețile reprezintă posibile căi de interacțiune a moleculelor de analit. ( b ) Pasivizarea suprafețelor canalului cu specii de blocare adecvate reduce legarea nespecifică, dar moleculele de blocare ocupă o mare parte din volumul cel mai sensibil de detectare a plasmonului. ( c ) Prin creșterea particulei metalice pe nanopilarul optimizat, câmpurile plasmonice sunt separate de substrat și de moleculele de pasivare. Această configurație crește semnificativ volumul efectiv de scanare și îmbunătățește performanța generală a senzorului.

Imagine la dimensiune completă

Materiale și metode

Producerea de substraturi de detectare

Lamele de sticlă (24 x 24 mm # 5) au fost purificate prin sonicare în acetonă și izopropanol timp de 5 minute și apoi acoperite cu titan (1 nm) și aur (50 nm) prin pulverizare prin pulverizare așa cum se arată în Figura 2a. Substraturile au fost apoi tratate pe scurt în plasmă de oxigen înainte de turnarea PDDA încărcată pozitiv (clorură de polidialdimetilamoniu, 0,2% în volum în apă, Sigma-Aldrich), așa cum se arată în FIG. 2b. După o clătire scurtă cu apă, o soluție de perle din polistiren (PS) încărcate negativ (0,1% în apă, Microparticles GmbH, Germania) a fost turnată pe substraturi (Figura 2c). În funcție de aplicație, fie margelele PS au fost îndepărtate de pe jumătate din suprafața substratului folosind o bandă cubică, fie substraturile au fost modelate prin imprimare cu micro-contact PDMS (Figura 2d). Margelele PS auto-asamblate au acționat ca o mască în timpul frezării ulterioare cu fascicul de ioni (Ionfab 300, Oxford Instruments, Marea Britanie; Figura 2e). Perlele PS au fost apoi îndepărtate cu un cub și substraturile au fost tratate în plasmă de oxigen pentru a îndepărta fragmentele reziduale de PDDA (Figura 2f).

Realizarea nanospațiilor cu nanopiloți. Etapele procesului de producție sunt următoarele:( A ) pulverizarea materialului; ( b ) turnarea unui film de polimer încărcat pozitiv; ( c ) auto-asamblare a perlelor de polistiren (PS) încărcate negativ; d ) microimaginare opțională utilizând o ștampilă PDMS; e ) măcinarea cu fascicul de ioni; ( f ) îndepărtarea mărgelelor PS rămase prin dezlipirea benzii; ( g ) gravarea substratului de sticlă în BOE; h ) microscop final cu nanodiscuri de aur pe nanopilari de sticlă.

Imagine la dimensiune completă

Producerea de structuri PDMS

Matrița de tipărire cu microcontact a fost realizată prin litografie cu laser pe o placă de siliciu (mrDWL 5-negativ fotorezist, Allresist GmbH, Germania). Parametrii procesului au fost reglați conform recomandărilor producătorului. Amestecul PDMS fără bule (10: 1, kit Sylgard 184, Dow Corning, SUA) a fost acoperit pe matriță la 250 rpm. După păstrarea în întuneric pentru

40 de ore, acest proces a dus la o grosime finală a PDMS. 0,75-1 mm. Membrana lipicioasă PDMS a fost curățată cu atenție, rulată pe un substrat de aur acoperit cu PS, unde a fost ținută în contact timp de 10 până la 20 de secunde, și apoi îndepărtată într-o singură mișcare continuă. O descriere detaliată a metodei de fabricare a PDMS microfluidic poate fi găsită în altă parte 31, 32 .

Spectroscopie optică

Spectrele de extincție medii au fost înregistrate pe un spectrofotometru UV-VIS-NIR (Cary 2000, Agilent Technologies, SUA). Monitorizarea în timp real a lungimii de undă LSPR a punctelor individuale de scanare a fost efectuată utilizând un ansamblu de extincție la domiciliu bazat pe o sursă de lumină colimată cu fibră cuplată (HL-2000, Ocean Optics, Dunedin, SUA) și un spectrometru cuplat cu fibră (BRC711E, B&W Tek, SUA). Măsurătorile simultane ale mai multor puncte de scanare au fost efectuate utilizând un dispozitiv de imagistică hiperspectrală 33, 34 construit în jurul unui microscop inversat (Eclipse Ti-E, Nikon, Japonia), un filtru de cristale lichide reglabil (LCTF, interval spectral 650 - 1100 nm, 7 lățime de bandă, Rezoluție de 1 nm, model Varispec SNIR, PerkinElmer, SUA) și cameră CMOS (Neo5, Andor Technologies, Marea Britanie). Sistemul nostru a fost special conceput pentru investigații în timp real paralele și analize din mers a mai multor locații de scanare prin sincronizarea și controlul tuturor componentelor optice de bază folosind cod Labview personalizat.

Simulări electrodinamice

Simulările de distribuție a spectrului optic și a câmpului apropiat au fost efectuate folosind o implementare comercială a domeniului de timp diferențial în timp (FDTD) (Lumerical, Inc., Canada) cu constante optice pentru aur bazate pe 35 și o formulare câmp total/câmp împrăștiat. D = 172, 200 sau 280 nm, grosime t = 60 nm, curbura marginii superioare și inferioare cu o rază de 5 nm și un unghi lateral de conicitate de 20 °. RI al suportului substrat/pilon a fost stabilit la n = 1,52 și structurile au fost înconjurate de apă (n = 1,33). Dimensiunea ochiurilor de plasă a fost de 4 nm, dar a fost ajustată la 0,5 nm în jurul discurilor și profilelor gravate.

Chimia suprafeței

Mai întâi, 0,1 mM SH-PEG-metoxi (5 kDa, Rapp Polymere, Germania) a fost dizolvat în etanol la 50 ° C. Substraturile au fost imersate în soluție PEG peste noapte și apoi atașate la structurile microfluidice ale PDMS prin legare termică la temperatură joasă ( 40 ° C) timp de 2 până la 3 ore. Imunoglobulinele anti-PEG Gs (IgG) E11 și E6.3 au fost preluate în glicerol 50% la o concentrație de 400 μg ml-1 (ref. 36). Neutravidina (NTV; ThermoFischer Scientific) a fost dizolvată în tampon (e) adecvat (e) la o concentrație de 50 μg ml-1 și utilizată ca atare.

rezultate si discutii

Am folosit o metodă de litografie coloidală 37 bine stabilită, ieftină și scalabilă 37 pentru a crea modele de nanodisc de aur cu rază scurtă de acțiune bine definite pe lamele standard de microscop de sticlă. Etapele de fabricație respective sunt ilustrate schematic în Figura 2a - 2f, unde am inclus și o etapă opțională (Figura 2d) de micro-eșantionare bidimensională bazată pe metoda non-lift dezvoltată de Andersson și colab. 38. Acest protocol de producție oferă probe pe deplin compatibile cu dispozitivele microfluidice și protocoale de testare dezvoltate anterior de Aćimović și colab. 32. Contrastul dintre regiunile nanoparticule și non-nanoparticule obținute prin această metodă este excelent, așa cum se arată în figura suplimentară.

Substraturile nanodisk reprezintă punctul de plecare pentru gravarea umedă (Figura 2g) pentru a forma nanodiscuri pe stâlpi îngustați, după cum au raportat Otte și colab. 29. Folosim gravarea standard cu oxid tamponat (BOE, 15% acid fluorhidric). După clătirea ușoară cu apă pentru a opri procesul de gravare, probele sunt uscate sub un curent de azot. Tensiunea superficială care rezultă din retragerea stratului subțire apos în timpul uscării poate provoca ruperea nanopilarilor, iar acest efect stabilește o limită a cât de subțire poate fi nanopilarul, care la rândul său limitează diametrul minim de nanodisc necesar pentru a realiza separarea EM. Din acest motiv, ne-am concentrat pe nanodisculuri de aur cu diametre mai mari, d decât am examinat anterior 29 .

Figura 3 rezumă modificările morfologice versus timpul de gravare pentru trei probe diferite de nanodisc Au cu d = 170-290 nm. Am emis ipoteza că ratele de gravare pot fi anizotrope datorită peisajului nanostructurat tridimensional. Pentru a testa această posibilitate, am determinat mai întâi rata de gravare verticală prin scanarea cu un profilometru peste limite cu d = 290 nm nanodiscuri. După cum se poate vedea în Figura 3a, aceste date sunt în acord excelent cu rata nominală cunoscută de gravare a sticlei în BOE în laboratorul nostru (

90 nm min-1). Apoi am imaginat substraturile folosind un microscop electronic de scanare (SEM) la un unghi de înclinare de 70 ° pentru a estima adâncimea gravării laterale direct sub nanodisks, obținută ca (d - d ')/2, unde d' este diametrul a nanopilarului cel mai apropiat de nanodisk. Datele din Figura 3a indică o rată de gravare laterală de 77,5 nm min-1 (potrivire liniară), demonstrând o anizotropie de gravare semnificativă, dar favorabilă, probabil din cauza omogenității difuziei. În cele din urmă, pe baza analizei imaginii SEM, am estimat diametrul nanopilar minim stabil mecanic la d be50 nm. Figura 3b compară discurile non-gravate (stânga) și discurile suportate de nanopilari d = 50 nm (dreapta).

Crearea nanopilarilor sub nanodischuri aurii prin gravare în BOE. A ) Adâncimi de gravare a sticlei verticale (puncte roșii) și laterale (puncte negre) pentru substraturi acoperite cu nanodiscuri aurii de diferite diametre d. Viteza nominală de gravare aprox. 90 nm min-1 este indicat printr-o linie întreruptă. Barele de eroare reprezintă abaterea standard a seturilor de date. ( b ) Imagini SEM la un unghi de înclinație de 70 ° din populațiile reprezentative de nanodiscuri de aur nemodificate și gravate cu diametru diferit d (scară la scară = 100 nm).

Imagine la dimensiune completă

Imagine la dimensiune completă

Am efectuat calcule electrodinamice folosind metoda FDTD pentru a justifica revendicarea noastră către departamentul EM și pentru a înțelege mai bine parametrii structurii optime. Am calculat răspunsul optic pentru nanodiscuri individuale cu un diametru de d = 172, 200 și 280 nm, care corespund îndeaproape cu valorile experimentale, dar am presupus dinamica izotropă de gravare pentru a scurta timpul de calcul și efortul de modelare. După cum este rezumat în Figura 4c, pozițiile de vârf calculate arată o tendință exponențială similară cu tendința observată în experimente. Lățimea liniei LSPR arată, de asemenea, descompunerea exponențială (Figura 4c, inserare), deși experimentele au arătat doar o scădere generală a lățimii complete până la jumătate maximă, probabil datorită lărgirii neomogene, de exemplu de la dimensiunea polidispersității mărgelelor PS (Figura 4b, inserare). Calculele arată că platourile rezonante nu sunt complet plate, parțial din cauza presupusei gravuri izotrope și nu anizotrope, dar au pante foarte mici în timp. Am verificat derivarea poziției rezonante în funcție de adâncimea de gravare pentru a determina cel mai înalt grad de detașare EM realizabil pentru diametrul minim nanopilar selectat d = 50 nm (Figura 4d). Datele arată că valoarea absolută minimă,

0, 12 nm pe nm grosimea stratului adsorbit, se obține pentru discuri de 200 nm. Derivații inițiali, la adâncimea zero de gravare, reprezintă răspunsul discurilor la un strat infinit de subțire cu RI = 1,52 format pe sticlă. Pentru un disc de 200 nm, această valoare este

De 40 de ori valoarea derivată pentru același disc acceptat de coloana d = 50 nm. Astfel, nanodiscul este substanțial separat de substrat pentru o structură gravată optim. Figura 4e ilustrează modificările corespunzătoare ale intensității EM câmpului apropiat la rezonanță pentru aceste două cazuri limitative, indicând o reducere semnificativă a suprapunerii spațiale între substrat și substrat pentru nanodiscul susținut de coloană.

Pentru a demonstra avantajul decuplării EM pentru aplicațiile cu biosenzori, am decis să lucrăm cu un sistem simplu de model care amintește de o strategie de testare ideală, așa cum se arată în figurile 1b și 1c. Folosim NTV ca entitate de pasivare datorită adsorbției sale aproape ireversibile pe sticlă la pH neutru 40. Receptorul este un tiol-PEG-metoxi de 5 kDa, care se leagă exclusiv de aur și respinge în mod eficient proteinele 41, îndeplinind astfel cerința unei contaminări încrucișate scăzute între speciile pasivante și stratul de biolecunoaștere al receptorilor. Am investigat mai întâi răspunsul LSPR al nanodiscurilor acoperite cu PEG la NTV (50 μg ml-1), care se așteaptă, prin urmare, să se lege aproape exclusiv de substratul de sticlă. Figura 5a rezumă răspunsul după injectarea NTV cu discuri de 210 nm expuse la gravarea 0, 10, 30 și 50 s în BOE. Pentru cel mai lung timp de gravare, care este semnificativ mai scurt de 65 s, limita pentru discurile de 210 nm, răspunsul scade cu aproximativ un ordin de mărime în comparație cu cazul necuprins (a se vedea inserția din Figura 5a pentru deplasarea absolută a vârfului). valori).

Imagine la dimensiune completă

25%. Astfel, putem concluziona că toate caracteristicile senzoriale de bază ale senzorilor LSPR nanodisc sunt îmbunătățite prin decuplarea EM, așa cum este rezumat în inserția din Figura 5b.

Compatibilitatea discurilor suportate de piloni cu procesul de aliniere încrucișată și fuzionare în interfața microfluidică PDMS pe scară largă. A ) Parte a dispozitivului în care 64 de pătrate lucioase (la pasajele dintre canale și substratul plasmonic de micropatie) reprezintă 64 de puncte de scanare. Aceste locații au fost utilizate pentru a verifica timpul de eșantionare și independența de zgomot a numărului de locații de scanare (datele nu sunt afișate). Inserția arată dispozitivul (24 × 24 × 5 mm) lângă monedă (1 SEK). ( b ) Sensogramă în timp real care compară interacțiunea a două tipuri de IgG anti-PEG în funcție de concentrația de anticorpi.

Imagine la dimensiune completă

concluzii