obiecte

abstract

Mycobacterium avium subsp. epitopii paratuberculozei (MAP) și virusului Epstein-Barr (EBV) determină un răspuns umoral consistent în serul pacienților cu scleroză multiplă, dar reactivitatea încrucișată împotriva proteinei omeline bazice de mielină (MBP) și a factorului de reglare a interferonului uman 5 (IRF5) nu a fost în spin cerebral CSF). Am evaluat serul și LCR-ul pacienților cu SM și alte boli neurologice (OND) cu răspuns umoral împotriva peptidelor EBV/MAP și IRF5/MBP. Datele noastre au arătat că peptidele EBV și MAP sunt capabile să inducă un răspuns imun specific umoral la pacienții cu SM comparativ cu controalele OND din ser și LCR. La pacienții cu SM, s-a observat sinteza intratecală specifică a IgG împotriva MBP și a omologului lor EBV și MAP, după cum se indică prin indicele anticorpilor. Răspunsul umoral împotriva EBV, MAP, MBP și IRF5 a fost semnificativ mai mare la pacienții cu SM comparativ cu serul și CSF OND. Prezența mai mare a anticorpilor anti-MBP și a MAP și EBV a acestora omoloage în LCR în timpul recidivelor sugerează un posibil rol pentru agenții patogeni în creșterea inflamației.

Rezultatul

Raportul CFS/Ser albumină și indicele de legătură

Pentru toate probele, indicele Link a fost evaluat ca un marker generic al sintezei IgG intratecale, raportul CSF/albumina serică (Q Alb) ca un marker al integrității BBB și procentul de probe cu diferite tipuri de deteriorare BBB și este prezentat Tabelul 1. Nu s-au observat leziuni semnificative statistic în grupurile BBB. SM comparativ cu celelalte grupuri, după cum reiese din indicele Link și raportul CFS/albumină.

Tabel în dimensiune completă

Elisa

Abs împotriva proteinelor EBV latente și litice EBNA1 și BOLF1, MAP și peptidele omoloage umane au fost monitorizate în serul și LCR-ul pacienților cu SM și în controalele IND, NIND, UND 5. Abs versus EBNA1 400-413 s-au găsit la 26 din 43 (60%) pacienți cu SM, în timp ce 3 din 17 (18%) martori IND, 2 din 11 (18%) NIND și doar un UND au fost pozitivi în ser (ASC = 0,74, p = 0,001) (Fig. 1A). În LCR, 17 din 43 (40%) SM, 3 din 33 (10%) IND, niciunul dintre cei 11 pacienți NIND și 5 UND (ASC = 0,80, p = 0,001) nu au fost găsiți pozitivi (Fig. 1B) . Pentru MAP_106c 121-132, 27 din 43 (63%) pacienți cu SM, 4 din 17 (24%) IND, 4 din 11 (36%) NIND și 1 UND au fost pozitivi (ASC = 0,73, p = 0, 008) în ser (Fig. 1C), în timp ce 23 din 43 (54%) pacienți cu SM, 3 din 17 (18%) IND, 2 din 11 (18%) NIND și niciunul dintre controalele UND nu au răspuns la MAP_106c 121-132 în LCR (ASC = 0,71, p = 0,02) (Fig. 1D). Pozitivitatea pentru MBP 85-98 a fost găsită la 27 din 43 (63%) pacienți cu SM, 5 din 17 (29%) IND, 4 din 11 (36%) NIND și doar un UND în ser (ASC = 0, 71, p = 0,03) (Fig. 1E). În LCR în rândul pacienților cu SM, am observat o situație similară, cu 33% din SM, 27% IND, 10% NIND și 0% UND pacienți cu pozitivitate MBP 85-98 (ASC = 0,7, p = 0,03) 1F).

avium

Patruzeci și trei de pacienți, șaptesprezece IND, unsprezece NIND și 5 UND au fost testați pentru reactivitate împotriva EBNA1 400-413, MAP_0106c 121-132, MBP 85-98, ser ( A, C, E ) și LCR. ( B, D, F ). Barele negre orizontale reprezintă valoarea medie, în timp ce valorile p sunt indicate de două săgeți cu săgeți care se topesc în partea de sus a fiecărei distribuții. Limitele de pozitivitate calculate prin analiza ROC sunt indicate prin linii punctate.

Imagine la dimensiune completă

Patruzeci și trei de pacienți, șaptesprezece IND, unsprezece NIND și 5 UND au fost testați pentru reactivitate împotriva plăcilor acoperite cu ser de BOLF1 305-320, MAP_4027 18-32 și IRF5 424-434 ( A, C, E ) și CSF ( B, D, F ). Barele negre orizontale reprezintă valoarea medie, în timp ce valorile p sunt indicate de două săgeți cu săgeți care se topesc în partea de sus a fiecărei distribuții. Limitele de pozitivitate calculate prin analiza ROC sunt indicate prin linii punctate.

Imagine la dimensiune completă

Tabel în dimensiune completă

Tabel în dimensiune completă

Analize de corelație

Au fost efectuate analize de corelație pentru a determina asocierea dintre pozitivitatea peptidelor. Am găsit o bună corelație cu peptida EBNA1 400-413 cu peptida omologă MAP_106c 121-132 în ser (R2 = 0,57; P 2 = 0,4; p

Grafic de împrăștiere care prezintă corelații între EBNA1 400-413 cu MAP_0106c 121-132 în ser ( A ) în CSF ( B ). EBNA1 400-413 și MAP_0106c 121-132 cu ser MBP 85-98 ( C, E ) în CSF ( D, F ) la pacienții cu SM. Corelația Pearson a fost calculată folosind Graph Pad 6.

Imagine la dimensiune completă

De asemenea, am găsit o corelație mai bună între Abs împotriva BOLF1 305-320 și peptida MAP_4027 18-32 în CSF (R2 = 0,54; p

Grafic de împrăștiere care prezintă corelații între BOLF1 305-320 și MAP_4027 18-32 în ser ( A ) în CSF ( B ). BOLF1 305-320, MAP_4027 18-32 cu ser IRF5 424-434 ( C, E ) în CSF ( D, F ) la pacienții cu SM. Corelația Pearson a fost calculată folosind Graph Pad 6.

Imagine la dimensiune completă

Test de concurs

Pentru a demonstra reactivitatea încrucișată între MAP/EBV și epitopii înșiși, am dezvoltat două teste competitive: o acoperire MBP 85-98 pe placă și cealaltă acoperire IRF5 424-434 pe placă (Fig. 5A, respectiv B). Pentru testul de concurență acoperit cu MBP 85-98 (Fig. 5A), la toți subiecții CSF (MS # 1, MS # 2 și IND), atât EBNA1, cât și MAP106 au inhibat efectiv legarea anticorpilor de peptida acoperită cu MBP. Într-o analiză competitivă cu IRF5 424-434 (Fig. 5B), atât BOLF1 cât și MAP 4027 au inhibat efectiv legarea acoperită cu IRF5 424-434 la toți subiecții CSF (MS # 1, MS # 2 și IND), în timp ce peptidele de control MAP 2694 au făcut-o să nu provoace nicio reducere a semnalului (Fig. 5A, B). Luate împreună, aceste rezultate arată că Abs anti-EBNA1 și anti-MAP106 vizează același epitop conformațional MBP și demonstrează, de asemenea, că Abs anti-BOLF1 și anti-MAP 4027 direcționate către același epitop conformațional IRF5 sunt reactive în CSF.

Test de competiție cu plăci ELISA acoperite cu MBP ( A ) și IRF5 ( B ). ( A ) LCR de la 2 pacienți cu SM și 1 IND au fost preincubate peste noapte cu concentrații saturate de [10 μM] MAP2694 38-46 (control negativ), EBNA1 400-413, MAP 106 121-132 și MBP 85-98 (control pozitiv), Prima coloană reprezintă o peptidă ELISA regulată (1: 2 CSF în PBS-T). ( B ) Același CSF a fost preincubat cu MAP2694 38-46 (control negativ), BOLF1 305-320, MAP_4027 18-32 și IRF5 424-434 (control pozitiv). Prima coloană reprezintă o peptidă ELISA regulată (1: 2 CSF în PBS-T).

Imagine la dimensiune completă

Indicele anticorpului specific IgG peptidic (AI) la pacienții cu SM

Indicele de anticorpi (AI) pentru toți pacienții cu SM a fost calculat cu următoarea formulă AI = QlgG [spec]/Qlim 7. Numărul ridicat de probe pozitive împotriva peptidelor selectate din grupul MS a avut AI> 1, 5, care au arătat producerea specifică IgG intratecală de anticorpi împotriva EBNA1 400-413, MAP 106, MBP 85-98 și BOLF1 305-320, MAP_4027 18– 32, peptide IRF5 424-434 așa cum se arată în Tabelul 4.

Tabel în dimensiune completă

discuţie

Acuratețea rezultatelor a fost confirmată de rezultatele corelației, faptul că s-a găsit triplă pozitivitate în ser și LCR împotriva BOLF1 305-320, MAP_4027 18-32 și IRF5 424-434 la pacienții cu SM comparativ cu absența în IND/NIND/Subiecții UND ne-au confirmat ipoteza că MAP și EBV ar putea aprinde procesul autoimun în SM și pozitivitatea pentru diferite peptide (EBNA1 400-413, MAP_106c 121-132 și MBP 85-98) în LCR ar putea fi legată de SM a pacienților recidivați comparativ cu pacienții cu SM fără recidivă.

Materiale și metode

obiecte

peptide

Peptidele sintetice derivate din antigene EBV (BOLF1 305-320, EBNA1 400-413), antigene MAP (409-188, MAP_0106C 121-132) și omologi umani (MBP 85-98, IRF5 424-434) au fost incluse în studiul 3, 4; peptidele au fost sintetizate comercial (LifeTein, South Plainfield, NJ 07080 SUA) cu o puritate de> 90% și depozitate congelate în alicote de unică folosință [10 mM] la -80 ° C.

ELISA

Test competitiv

Două MS și una IND CSF au fost supuse ELISA pe plăci acoperite MBP 85-98 sau IRF5 424-434. Testele competitive au fost efectuate pre-incubând CSF peste noapte la 4 ° C cu concentrații saturate de peptide [10 μM] (MBP 85-98; EBNA1 400-413; MAP 106) și (IRF5 424-434; BOLF1 305-320, Sero - peptida negativă (MAP 2694) a fost utilizată ca martor negativ [10 μM], iar CSF ELISA, MBP 85-98 sau IRF5 424-434 [10 μM] a fost un control pozitiv.

Indicele anticorpilor specifici IgG (AI)

Sinteza intratecală a EBNA1 400-413, MAP 106, MBP 85-98 și anticorpi specifici pentru BOLF1 305-320, MAP_4027 18-32 și IRF5 424-434 IgG a fost determinată de indicele anticorpului (AI) 7, 19, 20. Datele au fost normalizate împotriva puternicului control pozitiv inclus în toate experimentele a căror reactivitate a fost stabilită la 10.000 de unități arbitrare (AU)/ml. Indicele anticorpilor, incluzând concentrațiile serice de albumină și LCR, a arătat o barieră normală sânge/LCR (QIgG [total]> Qlim) 7. Am folosit următoarea formulă: AI = QIgG [spec]/Qlim, deoarece cu QIgG [spec] = IgGspec [CSF]/IgGs [ser] și Qlim 21 = 0,93 * √ (Qalb) 2 + 6 2 x 10 −6 - 1, 7 2 * 10 −3 7, 21 .

analize statistice

Analiza statistică a fost efectuată utilizând software-ul GraphPad Prism 6.0 (San Diego, CA, SUA). Valorile P utilizate pentru a compara diferitele categorii în analiza unică au fost calculate prin testul U Mann-Whitney. Diferențe cu p