obiecte

Acest articol a fost actualizat

abstract

Obezitatea a atins proporții de epidemie globală și cel puțin 2,8 milioane de persoane mor în fiecare an din cauza supraponderabilității sau obezității (OMS). Obezitatea este, de asemenea, un factor de risc major pentru rezistența la insulină, bolile cardiovasculare și diabetul de tip 2 (T2D) 1. Pacienții cu T2D sunt de obicei hiperglicemici și suferă de complicații precum hipertensiune arterială, accident vascular cerebral, ateroscleroză și cancer 2. Strategiile care reduc obezitatea promit reducerea mortalității și îmbunătățirea calității vieții persoanelor afectate.

Am arătat că administrarea sistemică a bilirubinei crește sensibilitatea la insulină prin suprimarea stresului ER și a inflamației la șoarecii DIO 35. Acum am extins aceste observații pentru a investiga dacă bilirubina reglează metabolismul lipidelor, așa cum se observă la pacienții cu boala Gilbert 34 și dacă bilirubina reglează nivelurile serice de adipokină la șoarecii DIO. De asemenea, am evaluat efectele pe termen mai lung ale tratamentului cu bilirubină asupra metabolismului lipidic și a nivelurilor de adipokine la 7 săptămâni după încetarea tratamentului cu bilirubină.

Rezultatul

Administrarea de bilirubină reduce greutatea corporală și îmbunătățește rezistența la insulină la șoarecii DIO

Tabel în dimensiune completă

sensibilitatea

( A ) Modificări ale greutății corporale a șoarecilor DIO tratați cu bilirubină (DIO + BR) sau vehicul (DIO + V) comparativ cu șoarecii martor hrăniți cu o dietă standard (CHOW). ( b ) Nivelurile zilnice de glicemie în repaus alimentar la șoarecii DIO + BR, DIO + V și CHOW în timpul tratamentului cu bilirubină. ( c ) Aportul mediu de 24 de ore pe șoarece la șoareci DIO care primesc BR sau vehicul. ( d ) Test de toleranță intraperitoneală la glucoză (GTT) la șoareci DIO și CHOW înainte de tratamentul cu bilirubină; e ) zona sub curba GTT. ( f ) Testul de toleranță la insulină (ITT) al șoarecilor DIO și al șoarecilor CHOW înainte de tratamentul cu bilirubină; ( g ) zona inversată sub linia de bază deasupra curbei. ( h ) Șoareci GTT DIO + BR, DIO + V și CHOW la 14 zile după prima injecție cu bilirubină; eu ) zona de sub curbă. ( j ) Șoareci ITT DIO + BR, DIO + V și CHOW la 14 zile după prima injecție cu bilirubină; ( k ) inversați zona de sub linia de bază deasupra curbei. În fiecare grup au fost incluși cel puțin 6 până la 8 șoareci; ** p

A ) Greutatea ficatului la șoarecii DIO + BR, DIO + V și CHOW. ( b ) Greutatea grăsimilor epididimale la șoarecii DIO + BR, DIO + V și CHOW. ( c ) fracțiuni în regiunea sacului în ficatul șoarecilor DIO + BR, DIO + V sau CHOW. ( d ) Diametre cu bule de grăsime (μm) ale adipocitelor epididimale DIO + BR, DIO + V sau CHOW. ( e ) Fotomicografii reprezentative ale colorării H&E a secțiunilor hepatice și a țesutului adipos de la șoareci DIO + BR, DIO + V și CHOW. Scara = 200 μm. Au fost analizați cel puțin 3 șoareci în fiecare grup; * p

Nivelurile serice de TC ( A ), LDL ( b ), HDL ( c ), TG ( d ), leptina ( e ), adiponectina ( f ), bilirubina totală g ) și bilirubina directă ( h ) la șoarecii DIO + BR, DIO + V sau CHOW au fost măsurați în ser imediat după încetarea tratamentului cu bilirubină. Fiecare grup conținea 3-4 șoareci; Datele sunt media ± abaterea standard; *** p

Expresia relativă a receptorului de insulină (ARN) mARN ( A ), SREBP-1 ( b ), Fasn ( c ) și ACC ( d ) în ficatul șoarecilor DIO + BR, DIO + V și CHOW, măsurați prin analiza RT-PCR. Valorile reprezintă expresia relativă a genei țintă comparativ cu expresia controlului endogen. ( e ) Exprimarea proteinei PPARγ și C/EBPa determinată în ficat de la șoareci DIO + BR, DIO + V și CHOW prin analiza Western blot. Gelurile au fost efectuate în aceleași condiții experimentale și sunt prezentate petele tăiate. ( f ) Expresia relativă a proteinei PPARγ și ( g ) C/EBPa în ceea ce privește controlul gliceraldehidei-3-fosfat dehidrogenazei (GAPDH) (software NIH ImageJ). Au fost analizate probe de la 3 șoareci individuali. Datele sunt media ± abaterea standard; *** p

( A ) Greutatea corporală a șoarecilor DIO + BR, DIO + V și CHOW în timpul experimentului de 9 săptămâni. ( b ) Nivelurile serice de glucoză la șoarecii DIO + BR, DIO + V și CHOW în timpul experimentului de 9 săptămâni. Ficat ( c ) și mase de grăsime epididimale ( d ) măsurată la 7 săptămâni după terminarea tratamentului. ( e ) (stânga) șoareci GTT DIO măsurați la 7 săptămâni după finalizarea tratamentului; (dreapta) valorile zonei de sub curba de deasupra liniei de bază; ( f ) (stânga) șoareci ITT DIO măsurați la 7 săptămâni după finalizarea tratamentului; (dreapta) valorile regiunii inverse deasupra curbei de sub linia de bază. Cel puțin 3 șoareci au fost incluși în fiecare grup. Datele sunt media ± abaterea standard; *** p

Cea mai importantă constatare a acestui studiu este că tratamentul cu bilirubină a redus nivelul colesterolului total la șoarecii DIO. Reducerea se poate datora schimbărilor atât ale nivelurilor HDL, cât și ale LDL, deși reducerea acestor elemente nu a atins semnificația statistică. Aceste constatări sunt în concordanță cu observațiile la persoanele cu sindrom Gilbert, în care nivelurile ușor crescute de bilirubină sunt asociate cu scăderea nivelului total de colesterol, LDL și trigliceride și sunt asociate cu scăderea statusului pro-inflamator și expunerea redusă la condiții oxidative 31, 34, 37, 38, 39. Deși nu a fost observată nicio modificare a nivelurilor de trigliceride la șoarecii tratați cu bilirubină la 14 zile după tratamentul cu bilirubină, s-a observat o reducere la 7 săptămâni după tratament, sugerând că efectul bilirubinei asupra nivelurilor de trigliceride poate fi întârziat. Studiul nostru a furnizat dovezi că bilirubina administrată exogen este asociată cu un profil lipidic modificat la șoarecii obezi.

Am constatat că administrarea bilirubinei a redus semnificativ nivelurile de leptină la șoarecii DIO. Aportul alimentar la șoarecii DIO tratați cu bilirubină nu pare să fie un factor în timpul tratamentului cu bilirubină și nu s-a observat nicio diferență în aportul alimentar după încetarea tratamentului. Scăderea nivelului de leptină la șoarecii tratați cu bilirubină se poate datora unei reduceri a țesutului adipos, care este susținută de scăderea expresiei SREBP-1. Celelalte două observații sunt relevante: se știe că leptina crește inflamația prin reglarea TNF-α 40, iar tratamentul cu bilirubină reduce expresia TNF-α la șoarecii DIO 35. Prin urmare, este rezonabil să presupunem că efectele bilirubinei asupra obezității se datorează alterării sintezei lipidelor, scăderii nivelurilor de leptină și scăderii producției de TNF-α. Relevanța clinică a bilirubinei trebuie investigată ca tratament potențial pentru reducerea sintezei lipidelor, după cum sugerează studiile efectuate la om 34 .

După cum au raportat și alți anchetatori 43, 44, am constatat că șoarecii DIO au prezentat niveluri mai ridicate de bilirubină totală și directă decât martorii Chow sau șoarecii DIO tratați cu bilirubină exogenă. Bilirubina crescută la animalele DIO poate reflecta blocarea secreției de bilirubină din cauza funcției hepatice afectate la acești șoareci. O posibilă explicație pentru reducerea nivelurilor de bilirubină la șoarecii DIO tratați cu bilirubină este că reducerea se poate datora capacității bilirubinei exogene de a regla P450. P450s sunt o superfamilie de enzime monooxigenază care conțin hem, care metabolizează o gamă diversă de compuși atât de origine endogenă, cât și de origine exogenă. Studiile au arătat că două izoforme diferite ale P450, CTP1A1 și CYP1A2, mediază o cale alternativă de degradare a bilirubinei 45, 46, 47. În plus, bilirubina poate regla direct activitatea enzimei CYP1A1 într-o manieră dependentă de receptorul 48 de arii carbohidrat, promovând astfel secreția de bilirubină. Astfel, se pare posibil ca acest mecanism să îmbunătățească secreția de bilirubină (și astfel să scadă nivelurile de bilirubină comparativ cu DIO singur) la șoarecii noștri DIO tratați cu bilirubină exogenă. Pentru a verifica această ipoteză vor fi necesare studii suplimentare dincolo de manuscrisul actual.

În acest studiu, am constatat că tratamentul cu bilirubină pe termen scurt a fost asociat cu o scădere a colesterolului total și o creștere a PPARγ și a adipokinelor. Aceste descoperiri oferă dovezi mecaniciste că metabolizarea bilirubinei sau a bilirubinei modificate (de exemplu, inhibitori parțiali ai UGT1A1 49) poate fi utilă ca abordare terapeutică pentru a reduce obezitatea și a îmbunătăți rezistența la insulină și toleranța la glucoză.

metode

Șoareci masculi C57BL/6 (în vârstă de 6 săptămâni) au fost achiziționați de la Institutul de Genetică și Biologie a Dezvoltării, Academia Chineză de Științe (Beijing, China). Șoarecii au fost hrăniți fie cu o dietă bogată în grăsimi (Tabelul 1), fie cu o dietă standard cu grăsimi CHOW (10% calorii din grăsimi) timp de 24 de săptămâni înainte de tratament. Comitetul pentru îngrijirea animalelor de la Universitatea Agricolă din Qingdao a aprobat toate experimentele pe animale. Metodele au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare aprobate.

Prepararea și administrarea bilirubinei

Bilirubina (Frontier Scientific, Logan, UT) a fost dizolvată în NaOH 0,1 N și pH-ul a fost ajustat la 7,4 cu HCI. Bilirubina a fost administrată intraperitoneal la 20 μmol/kg (11,7 mg/kg) de două ori pe zi timp de 14 zile. Șoarecii de control DIO sau CHOW au primit vehicul în același regim de injecție.

Monitorizarea șoarecilor după tratament

Nivelurile de glucoză din sânge și greutatea corporală la șoareci au fost măsurate zilnic la 9:00 a.m. O picătură de sânge integral (aproximativ 5-10 μl) a fost preluată dintr-o secțiune minimă a cozii de la capătul cozii șoarecelui și analizată folosind un glucometru Sannuo (San Nuo Inc., Changsha, China). Activitatea fizică a șoarecilor (inclusiv comportamentul, consumul de alimente, băutul și linsul) a fost observată zilnic, așa cum este descris în secțiunea 35. Aportul alimentar (cu excepția scurgerilor) a fost măsurat timp de 24 de ore la 7 zile după tratament și săptămânal timp de 7 săptămâni după tratamentul cu bilirubină.

Toleranță intraperitoneală la glucoză (IPGTT) și test de toleranță la insulină (ITT)

Pentru IPGTT, șoarecii au fost postiti peste noapte și apoi injectați cu 2 g/kg soluție de glucoză (ip). Pentru ITT, șoarecii au fost posti timp de 5 ore și apoi injectați cu 0,75 U/kg insulină (ip; Eli Lili, Indianapolis, IN). Nivelurile serice de glucoză au fost măsurate la 0, 15, 30, 60, 90 și 120 de minute după injectarea glucozei sau insulinei.

Colectarea țesuturilor, prepararea serului și biochimia sângelui

La sfârșitul fiecărui experiment, șoarecii au fost anesteziați și sângele a fost colectat prin sângerare retroorbitală într-un tub heparinizat. Plasma a fost obținută prin centrifugare și depozitată la -80 ° C pentru analiză ulterioară. Șoarecii au fost apoi sacrificați și ficatul și țesutul adipos epididimal au fost separate, cântărite și congelate rapid în azot lichid pentru o analiză ulterioară. Nivelurile serice de TC, TG, HDL, LDL și bilirubină au fost măsurate folosind seturi de reactivi specifici (Sigma Aldrich, Saint Louis, MO). Nivelurile de leptină, insulină și adiponectină au fost măsurate prin ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN).

Analiză în timp real (RT) -PCR

Expresia receptorului de insulină, a receptorului de leptină, a apolipoproteinei A-IV (Apoa4) și a SREBP-1 în ficat a fost cuantificată prin analiza RT-PCR așa cum s-a descris mai sus 50. Expresia actinei β a fost cuantificată prin RT-PCR în fiecare probă și utilizată ca control endogen. Primerii RT-PCR în timp real au fost achiziționați de la Life Technologies (Invitrogen Trading Co., Ltd., Shanghai, China).

Analiza Western blot

Conținutul de proteine ​​din lizatele de celule întregi a fost cuantificat prin test BCA și 30 μg de proteine ​​din fiecare probă au fost separate pe un gel Bis-Tris de 4-12% (Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, China). Proteinele au fost transferate la o membrană Hybond-P (GE health, Piscataway, NJ), blocate cu lapte degresat 5% și incubate cu următorii anticorpi primari: PPARγ, C/EBPa (Abcam, SUA) și GAPDH (Santa Cruz Biotechnology Inc., SUA), peste noapte la 4 ° C. Bloturile au fost apoi sondate cu anticorpi secundari marcați cu peroxidază de hrean (Sangon Biotech Ltd., Shanghai, China) timp de 45 de minute la temperatura camerei și vizualizați folosind un kit de detectare ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, Marea Britanie). Puterea fiecărui semnal a fost determinată utilizând software-ul Image J (NIH).

Colorarea hematoxilinei și eozinei (H&E)

Imunohistochimia ficatului de șoarece și a grăsimii epididimale a fost efectuată așa cum este descris 35. Pe scurt, secțiuni de ficat sau țesut adipos au fost fixate peste noapte în formalină tamponată 10%, încorporate în parafină și secționate. Diapozitivele au fost scufundate în hematoxilină filtrată timp de 6 minute, clătite cu apă și colorate cu Eozină încă 1-2 minute. Secțiunile au fost clătite cu apă și deshidratate în soluții alcoolice în creștere, curățate cu xilen și plasate cu o lamă de acoperire pe lamela etichetată. Diapozitivele au fost examinate cu un microscop Olympus BX51 cu dublă utilizare (Olympus, Tokyo, Japonia), iar imaginile au fost capturate cu o cameră digitală Olympus DP72. Aria vaccinului în aria totală a țesutului hepatic a fost determinată în ficat cu software-ul analitic Image-Pro Plus. Mediile individuale ale celulelor adipoase (n = 75 în fiecare grup) au fost măsurate utilizând software-ul CellSens Standard (Olympus).

analize statistice

Datele sunt exprimate ca medie ± SD. Diferențele dintre cele două grupuri au fost comparate în ceea ce privește semnificația statistică folosind testele t ale Studentului nepereche cu corecția Bonferroni. Diferențele au fost considerate semnificative atunci când p