sinergice

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Rezultatul
  • Terapia combinată cu metformină și liraglutidă este mai eficientă decât terapia unică în protejarea împotriva disfuncției endoteliale induse de acidul palmitic (PA).
  • Efectele terapiei combinate cu metformin și liraglutidă asupra funcției endoteliale vasculare la șoareci ApoE -/-
  • Reglarea în sus a nivelului receptorului GLP-1 (GLP-1R) și fosforilarea protein kinazei A (PKA) indusă de metformină poate contribui la efectele sinergice de protecție ale terapiei combinate.
  • Metformina restabilește nivelurile de GLP-1R afectate de PA și fosforilarea PKA în HUVEC prin intermediul protein kinazei activate de AMP (AMPK).
  • discuţie
  • Materiale și metode
  • reactivi
  • Studii in vitro
  • Pregătirea PA
  • Cultura și tratamentul celular
  • Interferența ARN
  • Detectarea ROS intracelular
  • Detectarea NO supernatant
  • Western blot
  • Studii in vivo
  • fiară
  • Pregătirea inelelor aortice și măsurarea vasodilatației
  • Colorarea HE și imunochimie
  • analize statistice
  • Mai multe detalii
  • Informatii suplimentare
  • Fișiere PDF
  • Informatii suplimentare
  • Comentarii

obiecte

  • Complicații diabetice
  • Receptorii hormonali

abstract

Studiile de cohortă și meta-analizele sugerează că diabetul de tip 2 este puternic asociat cu un risc crescut de multe boli cardiovasculare aterosclerotice 1, 2. Deși mecanismele exacte responsabile de ateroscleroza accelerată nu sunt pe deplin înțelese, disfuncția endotelială s-a dovedit a fi unul dintre primele evenimente în dezvoltarea aterosclerozei. Disfuncția endotelială se caracterizează prin sinteza scăzută a oxidului nitric (NO) și/sau biodisponibilitatea în mediul periendotelial, unde NO este responsabil pentru menținerea integrității țesutului vascular 3 .

Metformina este medicamentul cel mai frecvent prescris pentru tratamentul hiperglicemiei la pacienții cu diabet de tip 2. Studiile clinice au demonstrat efectele benefice ale metforminei asupra sistemului cardiovascular 4, 5, 6. În plus, metformina poate proteja direct celulele endoteliale de daune, care depășește efectele sale de scădere a glucozei 7, 8. Agenții de tip peptidă-1 (GLP-1) de tip glucagon (inclusiv analogii GLP-1 și inhibitori ai dipeptidil peptidazei 4) au fost recent aprobați ca noi opțiuni terapeutice pentru pacienții cu diabet zaharat de tip 2 pe baza dovezilor că GLP-1 poate stimula insulina secreție.din glucoză din celulele ß pancreatice. În plus față de efectul său de scădere a glucozei, GLP-1 are și alte efecte extra-pancreatice. Studiul recent LEADER (efectul și acțiunea Liraglutidei în diabet: evaluarea rezultatelor cardiovasculare) arată că tratamentul cu analogul liraglutidic și analogul GLP-1 reduce evenimentele cardiovasculare și decesul la pacienții cu diabet zaharat de tip 2 9. Foarte important, endoteliul vascular joacă un rol important în menținerea funcției cardiovasculare 10. Noi dovezi sugerează că GLP-1 și analogii săi au efecte protectoare directe asupra endoteliului vascular 11 .

Într-un studiu clinic, terapia combinată cu liraglutidă și metformină a arătat o scădere în greutate semnificativ mai mare și o incidență mai scăzută a hipoglicemiei comparativ cu terapia combinată cu glimepiridă și metformină 12, 13. În plus, la pacienții cu diabet de tip 2 cu control glicemic adecvat cu monoterapie cu metformină, adăugarea tratamentului cu liraglutidă a îmbunătățit mai mulți markeri de risc cardiovascular, sugerând că metformina și liraglutida pot avea efecte suplimentare sau chiar sinergice asupra vasculaturii 14. Cu toate acestea, dacă această terapie combinată are un efect sinergic asupra funcțiilor endoteliale este încă neclar din cauza lipsei de dovezi experimentale conexe. Prin urmare, în acest studiu, ne-am concentrat pe examinarea efectelor terapiei combinate cu metformină și liraglutidă asupra disfuncției endoteliale induse de lipotoxicitate și pe examinarea mecanismului de bază.

Rezultatul

Terapia combinată cu metformină și liraglutidă este mai eficientă decât terapia unică în protejarea împotriva disfuncției endoteliale induse de acidul palmitic (PA).

În celulele endoteliale ale venei ombilicale umane cultivate (HUVEC), disfuncția endotelială indusă de PA, care se caracterizează prin producția crescută de specii reactive de oxigen (ROS), niveluri scăzute de NO și niveluri scăzute de NO sintază endotelială fosforilată intracelulară (p-eNOS) mod dependent de concentrație. metoda (Fig. 1a). Disfuncția endotelială indusă de PA (0,5 mmol/l) a fost atenuată printr-un singur tratament cu o doză mai mare de metformină (0,5 și 1,0 mmol/l) sau liraglutidă (30 și 100 nmol/l). Cu toate acestea, la o doză mai mică de metformină (0,1 mmol/l) sau liraglutidă (3 și 10 nmol/l) nu s-a produs un astfel de efect protector (Figura 1b, c). În mod remarcabil, tratamentul combinat cu o doză mai mică de metformină (0,1 mmol/l) și liraglutidă (3 nmol/l) a avut un efect protector semnificativ asupra reglării crescute induse de PA a producției de ROS și o scădere a nivelurilor de proteine ​​NO și p-eNOS (Fig. 1). 1d, Figura suplimentară 1), indicând faptul că terapia combinată a fost mai eficientă decât un singur tratament pentru a proteja împotriva disfuncției endoteliale induse de PA.

( A ). HUVEC au fost pretratate cu diferite concentrații de metformină ( b ) și liraglutidă ( c ) singur sau în combinație cu ambele ( d ) timp de 2 ore și apoi expus la PA încă 22 de ore. Datele sunt prezentate ca mijloace ± SD. n = 4. * P # P -/- șoareci

A ) Niveluri de fosforilare GLP-1R și PKA afectate în HUVEC tratate cu PA. ( b ) Efecte dependente de doză ale metforminei asupra nivelurilor GLP-1R și fosforilării PKA în HUVEC cu PA afectată. Nivelurile de proteine ​​GLP-1R sau p-PKA au fost normalizate la GAPDH sau proteine ​​totale PKA. Datele sunt prezentate ca mijloace ± SD. n = 4. * P # P

Celulele au fost incubate cu exendina antagonistă a GLP-1R (9-39) ( A ) sau un inhibitor PKA H89 ( b ) timp de 30 de minute și apoi tratat cu metformină și liraglutidă timp de 2 ore și apoi expus la PA pentru încă 21,5 ore. Funcția endotelială a fost examinată, incluzând producția ROS (panoul superior), nivelul NO (panoul mediu) și nivelul proteinei p-eNOS (panoul inferior). Datele sunt prezentate ca mijloace ± SD. n = 4. * P # P † P

HUVEC au fost pretratate cu activator AICAR AMPK timp de 2,5 ore sau inhibitor AMPK C timp de 30 de minute și apoi au fost tratați cu metformină (1,0 mmol/l) singură ( A, b ) sau metformină (0,1 mmol/l) și liraglutidă (3 nmol/l) combinație ( c, d ) timp de 2 ore, urmat de expunerea la PA pentru încă 21,5 ore. Nivelurile de proteine ​​GLP-1R ( A, c ) sau p-PKA ( b, d ) au fost normalizate la proteine ​​GAPDH sau PKA totală. Datele sunt prezentate ca mijloace ± SD. n = 4. * P # P † P 10. O relație cauzală între acizii grași liberi și disfuncția endotelială a fost demonstrată în mai multe moduri 16, 17, 18, 19. PA este unul dintre acizii grași cel mai frecvent găsiți în dieta occidentală. În studiul nostru in vitro, PA a afectat semnificativ funcția endotelială, sugerând producția crescută de ROS intracelulară și scăderea nivelurilor de NO și fosforilarea eNOS. În mod similar, studiul nostru in vivo a demonstrat că vasodilatația dependentă de vasodilatație dependentă de vasodilatație la șoarecii ApoE -/- hrăniți cu HFD.

AMPK și PKA sunt doi regulatori cheie ai metabolismului celular. Interacțiunea dintre AMPK și PKA a fost bine documentată în mai multe studii 40, 41, 42. Activarea AMPK crește activitatea PKA, în timp ce PKA independent sau inhibă activitatea fosfatazei-2C proteine ​​specifice Ser/Thr, astfel modulând indirect activitatea AMPK în celulele vasculare ale mușchiului neted primar de șobolan 41. În acest studiu, am constatat că activarea AMPK a atenuat reducerea indusă de PA în fosforilarea PKA în HUVEC. Descoperirile noastre pot arunca o nouă lumină asupra rețelei de semnalizare din celulele endoteliale. În plus, inhibarea PKA a atenuat efectele metforminei asupra disfuncției endoteliale induse de PA, sugerând că PKA poate fi implicată în efectele protectoare ale metforminei asupra celulelor endoteliale. Cu toate acestea, sunt necesare studii suplimentare pentru a determina diafragma între căile AMPK și PKA pentru a îmbunătăți funcția endotelială.

Pe scurt, terapia combinată cu metformină și liraglutidă, un analog GLP-1, are un efect sinergic împotriva disfuncției endoteliale induse de PA. Funcția metforminei în reglarea ascendentă a nivelurilor GLP-1R și fosforilarea PKA în celulele endoteliale poate contribui la efectul protector sinergic al acestei terapii combinate, care oferă noi perspective asupra interacțiunii dintre metformină și agenții GLP-1 (Fig. 7). Este posibil ca metformina să poată spori sau spori efectele protectoare vasculare ale GLP-1 și ale analogilor săi. Descoperirile noastre oferă informații importante pentru proiectarea de noi strategii terapeutice bazate pe GLP-1 în tratamentul diabetului de tip 2.

Disfuncția endotelială indusă de acidul palmitic (PA) se caracterizează prin producția crescută de ROS, scăderea nivelului de NO și scăderea fosforilării eNOS. Tratamentul cu metformină sau liraglutidă în monoterapie poate preveni disfuncția indusă de celulele endoteliale PA. Terapia combinată cu metformină și liraglutidă are un efect sinergic asupra disfuncției endoteliale induse de PA. În plus, metformina reglează GLP-1R și semnalizarea PKA din aval, care poate fi responsabilă pentru efectele sale de protecție sinergice cu liraglutida în celulele endoteliale cu insuficiență PA. Metformina poate activa, de asemenea, semnalizarea PKA într-un mod independent de GLP-1R. Efectele de mai sus ale metforminei sunt mediate de calea AMPK. Săgețile roșii indică noile noastre descoperiri în acest studiu.

Imagine la dimensiune completă

Materiale și metode

reactivi

Liraglutida a fost furnizată de Novo Nordisk (Bagsvaerd, Danemarca). PA, inhibitorul AMPK Compusul C și exendina antagonistă GLP-1R (9-39) au fost achiziționate de la Sigma (St. Louis, MO, SUA). Activatorul AMPK AICAR a fost de la Beyotime Biotechnology (Shanghai, China). Inhibitorul PKA H89 a fost furnizat de Cell Signaling Technology (Beverly, MA, SUA). Anticorpii anti-eNOS și anti-fosfo-Ser-1177-eNOS (p-eNOS) ai șoarecilor provin de la BD Biosciences (San Joe, CA, SUA). Anticorpul monoclonal anti-GLP-1R murin a fost de la DSHB (Iowa, IA, SUA). Anti-PKAα de iepure, anti-fosfo-Thr197-PKA C (p-PKA), anti-AMPKα și anti-fosfo-Thr-172-AMPKα (p-AMPK) au fost obținute de la Cell Signaling Technology. Anticorp anti-GAPDH de șoarece de la Zhongshan Biotechnology (Beijing, China).

Studii in vitro

Pregătirea PA

PA 256 mg se dizolvă în 5 ml etanol absolut și apoi se titrează cu 0,1 ml/l de hidroxid de sodiu 5 ml la 70 ° C. În cele din urmă, un amestec de 10 ml PA cu 190 ml BSA 10% la 55 ° C a fost adăugat pentru a forma complex la concentrații de 5 mmol/l. Soluția mamă a fost sterilizată prin filtrare și depozitată la -20 ° C. În mod similar, a fost preparată o soluție martor conținând 5% etanol și 9,5% BSA.

Cultura și tratamentul celular

HUVEC-urile au fost colectate de la donatori sănătoși cu consimțământul informat în scris. Protocolul acestui studiu a fost aprobat de Comitetul de Etică al celui de-al Treilea Spital din Beijing. Toate procedurile efectuate au fost în conformitate cu orientările și reglementările relevante. HUVEC-urile au fost preparate și cultivate așa cum s-a descris anterior 43. Toate experimentele au fost efectuate folosind celule la pasajul 6. O serie de concentrații de PA (0, 125, 0, 25 și 0,5 mmol/l) au fost utilizate pentru a incuba timp de 24 de ore pentru a induce disfuncția endotelială. În majoritatea studiului nostru, expunerea la HUVEC de 0,5 mmol/l PA a fost utilizată ca model deteriorat. Pretratarea HUVEC cu metformin (0, 1, 0, 5 și 1,0 mmol/l) sau liraglutidă (3, 10, 30 și 100 nmol/l) a fost efectuată cu 2 ore înainte de expunerea la PA și timp de 22 de ore. Într-un experiment combinat, celulele au fost tratate cu metformină (0,1 mmol/l) și liraglutidă (3 nmol/l). Pentru a elucida căile de semnalizare implicate, celulele au fost incubate cu AICAR (0,5 mmol/L), Compus C (10 μmol/L), Exendin (9-39) (200 nmol/L) sau H89 (10 μmol/L). timp de 30 de minute. min. înainte de alte tratamente.

HUV-EC-C, o linie celulară HUVEC, a fost utilizată în experimentul de eliminare. Această linie celulară provine de la Centrul de resurse celulare de la Shanghai Life Science Research Institute (China) și a fost cultivată în DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA) suplimentat cu 10% FBS.

Interferența ARN

Pentru a reduce la tăcere expresia genelor GLP-1R și PKA, celulele au fost transfectate cu siARN folosind lipofectamină RNAi MAX (Invitrogen). Au fost incluse trei forme de ARNsi pentru fiecare eliminare a unei gene specifice, iar ARNsi amestecat fără legătură a fost utilizat ca control fără nicio identitate în secvența genomică umană. După transfecție timp de 48 de ore, celulele au fost tratate cu metformină (1,0 mmol/l) timp de 2 ore, urmate de expunerea la PA pentru încă 22 de ore.

Detectarea ROS intracelular

ROS a fost măsurat utilizând o sondă fluorescentă diacetat de 2 ', 7'-diclorofluorescină (DCFH-DA, Sigma), care poate fi hidrolizată la DCFH în celule. Când DCFH non-fluorescent este oxidat de ROS, acesta va fi transformat în DCF cu fluorescență ridicată. Pe scurt, la sfârșitul tratamentului, celulele au fost incubate cu DCFH-DA (20 μmol/L) timp de 30 de minute la 37 ° C și apoi spălate de două ori. Intensitatea fluorescenței DCF a fost testată cu un citometru de flux (BD Biosciences). Controalele au fost stabilite ca niveluri de ROS 100%.

Detectarea NO supernatant

NO a fost determinat prin metoda nitrit reductazei folosind un kit de la Beijing 4A Biotech Co., Ltd (China). La sfârșitul tratamentului, supernatanții culturii celulare au fost colectați din fiecare grupă. Pentru a configura testul, s-au preparat tuburi cu 0,1 ml de apă distilată, soluție standard și probe de tratament și apoi s-au adăugat PBS și nitrat reductază la fiecare tub. După incubare timp de 1 oră la 37 ° C, s-au adăugat două soluții de lucru pentru co-incubare timp de încă 10 minute. Absorbanta la 450 nm in fiecare tub a fost masurata folosind un cititor de microplaci. Nivelul NO al fiecărui grup a fost normalizat la proteina sa totală.

Western blot

Proteinele au fost separate cu 10% (g/v) SDS-PAGE și transferate la o membrană de nitroceluloză. Membranele au fost testate cu anticorpi primari (toate la o diluție de 1: 1.000) peste noapte la 4 ° C și ulterior incubate cu IgD de capră anti-iepure conjugată cu IRC 800CW sau IgG de capră anti-șoarece (ambele la o diluție de 1: 10.000); LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, SUA) timp de 1 oră. Benzile de proteine ​​au fost vizualizate folosind un sistem de imagistică cu infraroșu Odyssey (LI-COR Biosciences).

Studii in vivo

Experimentele pe animale au fost aprobate de Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de la Universitatea din Beijing și au fost efectuate în conformitate cu orientările naționale și internaționale. Șoareci masculi de tip sălbatic de opt săptămâni și ApoE -/- (Vital River Animal Center, Beijing, China) au fost adăpostiți în condiții specifice fără patogeni, cu un ciclu de lumină-întuneric de 12 ore. Experimentele au fost efectuate după o săptămână de aclimatizare. Șoarecii de tip sălbatic au fost hrăniți cu o dietă normală, în timp ce șoarecii ApoE -/- au fost hrăniți cu HFD conținând 0,15% colesterol și 41% grăsimi (MD12015, Medicine Ltd, Yangzhou, Jiangsu, China) timp de 8 săptămâni. În ultimele patru săptămâni, șoarecii ApoE -/- au fost împărțiți în patru grupuri (6 șoareci per grup), inclusiv martor (PBS, ip, de două ori pe zi), metformină (100 mg/kg pe zi, apă potabilă și PBS) ip, de două ori pe zi), liraglutidă (30 μg/kg pe zi, ip, de două ori pe zi) și combinația (metformină, 100 mg/kg pe zi, cu apă potabilă; și liraglutidă, 30 μg/kg pe zi, ip, de două ori) pe zi ). Greutatea corporală a fost măsurată înainte de tratament și apoi săptămânal până la sacrificiu.

Pregătirea inelelor aortice și măsurarea vasodilatației

După laparotomia liniei medii sub anestezie pentobarbitală de sodiu, aorta a fost rapid excizată pentru a măsura reactivitatea vasculară, așa cum s-a descris mai sus 44. După stabilizarea în tampon Krebs timp de 30 de minute, inelele aortice au fost depolarizate cu clorură de potasiu (60 mmol/l) pentru a evalua contracția lor maximă. După două spălări, inelele aortice au fost retrase prin stimulare cu fenilefrină (10-6 mol/l). Când răspunsul contractil a fost stabilizat (faza de echilibru, 15 minute), au fost examinate răspunsurile vasorelaxante la o concentrație crescută de Ach. Tensiunea de repaus a inelelor aortice a fost ajustată la 1,0 g. Modificările tensiunii vasculare au fost detectate de un aparat de înregistrat cu stilou (ADInstruments, Bella Vista, Australia).

Colorarea HE și imunochimie

Țesuturile aortice, inclusiv rădăcinile aortice și aorta ascendentă, au fost colectate pentru prepararea secțiunilor groase de 7 μm. Secțiunile de țesut au fost identificate mai întâi prin colorarea HE. Pentru colorarea imunochimică, secțiunile au fost tratate cu 3% peroxid de hidrogen timp de 10 minute pentru a bloca activitatea peroxidazei endogene și au fost incubate în ser normal de cal tamponat pentru a preveni legarea nespecifică a anticorpilor. Secțiunile au fost apoi incubate cu anticorp împotriva p-eNOS (1:50; Sigma) sau GLP-1R (1:10) peste noapte la 4 ° C și supuse analizei imunohistochimice.

analize statistice

Datele sunt prezentate ca medie ± SD. Diferența dintre grupuri a fost analizată de ANOVA unidirecțional, urmată de testul post-hoc Tukey-Kramer. O valoare P