uman

  • obiecte
  • abstract
  • Fundal:
  • metode:
  • rezultatele:
  • concluzie:
  • Principalul
  • discuţie
  • metode
  • Izolație GAG
  • Bacteriile și condițiile de cultivare
  • Linii telefonice
  • Determinarea viabilității celulare
  • Test de aglutinare
  • Experimente de adeziune celulară
  • Adeziune E coli O119 a S. fyris la monostratele celulare în prezența GAG
  • Analiza statistică și aprobarea etică
  • Declarația de sprijin financiar
  • dezvăluire

obiecte

abstract

Fundal:

Sugarii alăptați au o incidență mai mică a gastroenteritei acute datorită prezenței mai multor factori antiinfecțioși în laptele uman. Scopul acestei lucrări este de a studia capacitatea glicozaminoglicanilor din laptele uman (GAG) de a inhiba aderența unor bacterii patogene comune.

metode:

GAG-urile au fost izolate dintr-un set de probe de lapte prelevate de la diferite mame în prima lună de lactație. Au fost efectuate experimente pentru a studia capacitatea GAG de a inhiba aderența a două microorganisme intestinale (enteropatogenul Escherichia coli serotip 0119 și Salmonella fyris) la liniile celulare Caco-2 și Int-407.

rezultatele:

Studiul a arătat că GAG-urile au avut un efect antiadeziv asupra celor două tulpini patogene studiate cu grade diferite de inhibare. Mai ales în prezența laptelui uman GAG, aderența S. fyris la celulele Caco-2 și la celulele Int-407 ale ambelor tulpini testate a fost semnificativ redusă.

concluzie:

Rezultatele noastre au arătat că GAG în laptele uman poate fi unul dintre factorii importanți de apărare împotriva infecțiilor diareice acute la sugarii alăptați.

Principalul

În copilărie, diverse bacterii, viruși și paraziți sunt responsabili de infecțiile gastro-intestinale. Există dovezi convingătoare care susțin o corelație între alăptare și o incidență mai scăzută a diareei. De fapt, există mai mulți antiinfecțioși în laptele uman (anticorpi secretori, lactoferină, oligozaharide etc.) (1, 2). În special, oligozaharidele au mai multe roluri importante de protecție, fiziologice și biologice, inclusiv stimularea creșterii pentru microbiotice intestinale benefice și inhibarea aderenței și imunoreglării agenților patogeni (3, 4).

Glicozaminoglicanii (GAG) sunt polizaharide naturale foarte sulfatate, complexe, liniare, formate prin repetarea unităților dizaharidice. În general, acestea sunt împărțite în patru clase: hialuronan, sulfat de keratan, galactosaminoglicani sulfatați reprezentați de sulfat de condroitină și sulfat de dermatan care poartă d-galactozamină, și glucozaminoglicanii sulfatați cu heparan sulfat și heparină cu d-glucozamină. Fiecare unitate dizaharidică specifică constă dintr-un reziduu de hexozamină (galactozamină sau glucozamină) care este înlocuit cu acid hexuronic (acid glucuronic sau iduronic), cu excepția galactozei care conține keratan sulfat. Grupările sulfat sunt esterificate în diferite poziții ale lanțurilor coloanei vertebrale ale carbohidraților care produc structuri cu secvențe eterogene ridicate și densități de încărcare (5).

Spre deosebire de oligozaharide, GAG-urile sunt capabile să interacționeze în mod specific (și în mod specific) cu alte componente biologice datorită prezenței unui număr mare de grupări sulfat și carboxil capabile să genereze secvențe foarte specifice care produc interacțiuni anionice puternice (5, 6, 7). Ca rezultat, s-a demonstrat că GAG-urile din laptele uman ar putea juca un rol de receptori solubili și, prin urmare, au capacitatea de a inhiba legarea diferiților agenți patogeni de mucoasa intestinală, protejând astfel copilul de infecții. În plus, s-a demonstrat recent că hialuronanul din laptele uman stimulează protecția antimicrobiană de protecție la nou-născuți (8).

După studii de pionierat de Newburg și colab. (9), a fost recent anunțată o evaluare completă cantitativă și calitativă a GAG-urilor, atât în ​​ceea ce privește laptele matern prematur, cât și cel prematur (10, 11). Cantitativ, cea mai mare concentrație de GAG ​​a fost găsită în colostru (9, 3 și 3, 8 g/l în laptele prematur și termic), urmată de o scădere progresivă la 4, 3 și 0,4 g/l la sfârșitul primei luni de lactatie. Aceste date indică faptul că nou-născuții care sunt alăptați primesc aceeași cantitate de GAG ​​în fiecare zi. Din punct de vedere calitativ, sulfatul de condroitină și respectiv sulfatul de heparan/heparina 55. 42% din totalul GAG-urilor, în timp ce sulfatul de dermatan și hialuronanul reprezintă restul de 3% (12).

GAG-urile din lapte sunt sintetizate în glanda mamară prin acțiunea secvențială a glicoziltransferazelor specifice legate de un „nucleu” proteic și secretate ca proteoglicani. La nivelul intestinului subțire, enzimele proteolitice secretate în sucul pancreatic scindează „nucleul” proteoglicanilor, eliberând lanțuri GAG. Deoarece peretele intestinal și microvili nu conțin glicozidaze și sulfataze specifice, GAG-urile libere rămân nedegradate în tractul gastro-intestinal superior (13), unde ar putea acționa ca receptori solubili și ar putea juca un rol antiinfecțios, așa cum s-a arătat pentru laptele uman. oligozaharide (14).

Scopul acestui studiu este de a verifica dacă complexul GAG din laptele uman purificat este capabil să inhibe aderența a două bacterii diareice patogene în copilărie, cum ar fi Escherichia coli și Salmonella fyris (

Inhibarea adeziunii bacteriene la celulele intestinale de către glicozaminoglicanii (GAG). Aderența (procentul de inocul original) de E. coli O119 și S. fyris ( A ) și Caco-2 și ( b ) pe celulele Int-407 în prezența (bare gri) și absența (bare negre) a GAG. Valorile sunt exprimate ca medie ± SD. Simbolurile din figură indică valori semnificative statistic în comparație cu controlul. * P = 0, 012. ** P = 0, 0043. † P = 0, 0412.

Imagine la dimensiune completă

  • Descărcați un diapozitiv PowerPoint

Microscopie cu lumină standard a monostratelor de celule colorate cu Giemsa infectate cu E. coli O119. Aderența la monostraturi Int-407 în ( A ) absență și ( b ) în prezența glicozaminoglicanilor (GAG): s-a observat o reducere semnificativă a aderenței la E. coli O119 în prezența GAG-urilor. Aderența la monostratele Caco-2 în absență ( c ) A ( d ) GAG: în prezența GAG, nu s-a observat niciun efect al GAG asupra aderenței E. coli O119 la monostratele Caco-2. Mărire = × 1 000. Bară = 0,01 mm.

Imagine la dimensiune completă

  • Descărcați un diapozitiv PowerPoint

discuţie

Infecția microbiană este un proces complicat care depinde în mare măsură de relația gazdă-microb. Adeziunea este de obicei primul pas care duce la colonizare și infecție ulterioară (16). Diferite componente celulare ale celulelor și țesuturilor eucariote au fost identificate ca ținte pentru aderența microorganismelor, iar multe dintre ele sunt caracterizate ca proteoglicani. Studii recente sugerează că moleculele care conțin carbohidrați în loc de proteine ​​mediază legarea bacteriană de suprafața celulelor eucariote (17). Au fost descrise o serie de specificități de legare a carbohidraților și, în unele cazuri, legarea bacteriană de celulele animale animale a fost direct asociată cu interacțiunile cu GAG (18, 19). Procesul general de legare implică întâlnirea unui glican polihidroxilat solvatat situat pe suprafața celulei cu un site de combinare a proteinelor solvatate (adezina) prezent în agentul patogen. Forțele implicate în această legătură sunt reprezentate de legarea hidrogenului, interacțiunile Van der Walls și atracția sarcinii și dipolului (20, 21), sugerând că, dacă suprafața glicanului este complementară sitului de combinare a proteinelor, apa poate fi expulzată și legată o să se întâmple.

Receptorii prezenți la suprafață sunt formați din resturi de oligozaharide ale glicoproteinelor și glicolipidelor membranelor celulare. S-a demonstrat că aderența la acești receptori poate fi inhibată sau redusă prin prezența oligozaharidelor libere cu o structură analogă cu cea a receptorilor celulari, astfel încât agentul patogen să se lege de aceștia și nu de membrana celulară, cu un efect patogen redus datorat până la (22).

Datele disponibile până în prezent cu privire la activitatea oligozaharidelor din laptele uman împotriva E. coli și S. fyris arată capacitatea fracțiunilor care conțin fucozil oligozaharide de a inhiba aderența E. coli O119 enteropatogenă. În plus, efectul antiadeziv asupra S. fyris, deși destul de slab, a fost obținut cu oligozaharide acide și neutre cu greutate moleculară mică (14).

Așa cum s-a demonstrat deja pentru alți carbohidrați din laptele uman (oligo), GAG-urile exogene au demonstrat că sunt inhibitori competitivi ai aderenței bacteriene, printre care heparina a fost cea mai studiată (3, 23). În ceea ce privește posibilul rol fiziologic al GAG-urilor în tractul gastro-intestinal al sugarilor alăptați, este important să subliniem că GAG-urile nedigerate intră în intestinul subțire deoarece nu există enzime specifice prezente pe peretele intestinal care le-ar putea degrada. Prin urmare, aceste molecule s-ar putea comporta ca receptori solubili care au capacitatea de a interacționa cu agenții patogeni și de a concura pentru aderența lor la peretele intestinal.

Acest studiu confirmă faptul că GAG-urile sunt eficiente în inhibarea aderenței S. fyris la celulele Caco-2 și Int-407 și a adeziunii E. coli O119 numai la Int-407. Pe de altă parte, prezența GAG nu inhibă semnificativ adeziunea E. coli O119 la celulele Caco-2. Valorile aderenței pentru celulele S. fyris și E. coli O119 la celulele Int-407 sunt în concordanță cu valorile date mai sus prin compararea diferitelor configurații de cultură celulară ca model de epiteliu intestinal (24). Procentele de aderență ale acestor bacterii au scăzut atunci când suspensiile celulare au fost co-incubate cu GAG, sugerând că GAG-urile pot fi implicate în interacțiunea bacteriană-celulă epitelială.

În ceea ce privește E. coli O119 și lipsa inhibării specifice a aderenței la Caco-2, acest fenomen poate fi explicat prin diferitele structuri moleculare ale receptorilor aparținând celor două tipuri de celule. Stocul de GAG ​​din lapte uman poate fi mai similar cu receptorii Int-407 decât GAG-ul situat pe Caco-2. În plus, studiile anterioare au sugerat că aderența redusă se datorează nivelurilor mai scăzute de proteine ​​aderente, mai degrabă decât inhibării fizice (25, 26). Diferitele grade de inhibare a aderenței la celulele Int-407 în comparație cu celulele Caco-2 ar putea reflecta, de asemenea, originea (embrionară și adultă) a celor două linii celulare. De fapt, celulele de carcinom de colon uman Caco-2, utilizate în mod obișnuit pentru a studia aderența agenților patogeni intestinali la celulele umane și citotoxicitatea enterobacteriilor, sunt mai apropiate fiziologic de țintele naturale ale agenților patogeni, deoarece enterocitele precum polaritatea celulară și limita apicală 27). Pe de altă parte, Int-407, utilizat și în experimentele de adeziune (28), sunt celule intestinale embrionare umane, care au, prin urmare, o posibilă structură moleculară diferită de receptori în comparație cu Caco-2.

GAG-urile din laptele uman testate sunt eficiente împotriva S. fyris și E. coli O119, deși de intensitate variabilă. GAG-urile s-au dovedit a fi eficiente în inhibarea legării HIV de receptorul GP-120 (9). Hill și colab. (8) au arătat recent că hialuronanul din laptele uman inhibă adeziunea S. typhimurium la celule. Rezultatele de mai sus indică faptul că GAG-urile din laptele uman au capacitatea de a acționa separat la diferiți receptori specifici. Acest efect poate fi legat de compoziția lor eterogenă, structura și proprietățile fiecărei componente polizaharidice individuale. Rezultatele noastre actuale privind capacitatea GAG din laptele uman de a inhiba aderența enteropatogenilor la celulele intestinale, așa cum sa raportat deja pentru oligozaharidele din laptele uman, sunt o demonstrație suplimentară că efectul antiinfecțios al laptelui uman se datorează prezenței substanțelor bioactive (macro ) molecule capabile să protejeze nou-născuții de bacteriile patogene la nivel gastro-intestinal.

Pe baza acestor rezultate, se vor efectua cercetări suplimentare folosind diferite concentrații de GAG-uri, precum și o componentă purificată prezentă în GAG-uri complexe care conțin lapte uman pentru a înțelege mai bine rolul lor fiziologic posibil și implicarea lor în inhibarea mecanismului de aderență bacteriană.

metode

Izolație GAG

GAG-urile pentru laptele uman au fost obținute dintr-un set de probe prelevate în prima lună de lactație și depozitate la -20 ° C până la utilizare. GAG-uri gratuite purificate au fost obținute și izolate așa cum este descris în detaliu (10). Pe scurt, porțiuni individuale de lapte uman au fost degresate cu acetonă și, după centrifugare și uscare la 60 ° C, peleta a fost solubilizată într-un tampon adecvat și tratată cu o enzimă proteolitică. După fierbere și centrifugare timp de 10 minute, GAG liber a fost precipitat cu trei volume de etanol. Precipitatul a fost obținut prin centrifugare, uscat la 60 ° C și purificat pe o coloană ambalată cu rășină schimbătoare de anioni. Fracțiile coloanei pozitive cu acid uronic (29) care conțin GAG liber au fost reunite și precipitate în continuare cu etanol. În cele din urmă, după centrifugare și uscare, GAG-urile din lapte uman complex purificat liber au fost analizate pentru puritate și compoziție și utilizate pentru experimentele de aderență.

Compoziția GAG-urilor purificate a fost evaluată prin electroforeză pe gel de agaroză (30) și determinarea dizaharidelor după tratament enzimatic specific (10). Puritatea GAG-urilor complexe a fost mai mare de 85%, determinată de testul acidului uronic (29), cu un reziduu format din sare și un conținut foarte scăzut (