obiecte
Leucemia limfocitară cronică (LLC) se caracterizează prin acumularea în sânge și organele limfoide primare ale celulelor B mature, dar nefuncționale pe termen lung. Se știe că interacțiunile celulelor leucemice cu micromediul sunt critice pentru supraviețuirea celulelor CLL in vivo. Celulele CLL pot supraviețui mult timp in vivo, în timp ce celulele suferă apoptoză rapid in vitro. Această apoptoză spontană și sensibilitatea la medicamente a celulelor CLL observate in vitro sunt puternic reduse în prezența celulelor stromale, 2, 3, 4, 5, care furnizează stimuli celulelor CLL în principal prin contact direct. Astfel, mimarea condițiilor in vivo pentru a investiga mecanismele implicate în rezistența la CLL necesită înființarea sistemelor coculturale. MicroARN-urile (miARN) sunt regulatori importanți ai expresiei genelor și contribuie la patologia LLC. 6, 7, 8 Recent, a fost descrisă o mare schimbare a nivelurilor de miARN în celulele CLL după cultivarea directă pe celule stromale. 9, 10
Imagine la dimensiune completă
Pentru a confirma în continuare rezultatele noastre, am efectuat experimente coculturale de celule CLL cu diferite tipuri de celule stromale. Celulele CLL au fost recoltate după 24 de ore prin pipetare ușoară pentru a obține toate celulele CLL. Examinarea microscopică atentă a confirmat integritatea generală a monostratului de celule stromale. Analiza microARN a celulelor obținute a arătat o creștere dramatică a nivelurilor miR-99a și miR-125b (Figura 2a), confirmând rezultatele descrise de Willimott și Wagner 9 folosind celule stromale de fibroblast de șoarece. În schimb, o creștere a nivelurilor miR-9 raportate în celulele CLL după cultivarea pe fibroblaste de șoarece 9 nu a fost detectată după cultivarea pe celule BM-MSC sau HMEC-1 (datele nu sunt prezentate). Interesant, miR-9 nu a putut fi detectat în celulele BM-MSC și HMEC-1, dar a fost mai abundent în celulele NIH/3T3.
Influența contaminării cu celule stromale asupra nivelurilor de miARN în suspensiile de celule CLL. Celulele CLL au fost cultivate în plăci cu șase godeuri la 3 x 106/ml pe celule stromale confluente 60% timp de 24 de ore. miR-99a și miR-125b au fost detectate de RT-qPCR folosind teste microRNA TaqMan. ( A ) Nivelurile de microARN în celulele CLL după cultivarea pe BM-MSC sau HMEC-1. Celulele CLL au fost obținute prin pipetare ușoară în sus și în jos. Rezultatele au fost normalizate la ARN U6. ( b ) Cuantificarea microARN-ului în celule CLL cultivate singure și amestecate cu supernatante de celule stromale. Supernatanții celulelor stromale și suspensiile CLL au fost îndepărtate din godeuri fără pipetare prealabilă pentru a preveni orice separare a celulelor. ( c ) Nivelurile de microARN în celulele CLL și peletele obținute din supernatanții celulelor stromale. Rezultatele sunt raportate în valori Ct corespunzătoare RT-qPCR de volume egale de ARN. ( d ) Cuantificarea microARN în celule CLL contaminate intenționat cu celule stromale la un raport de 1: 1000 stromal: celule CLL. Rezultatele au fost normalizate la ARN U6.
Imagine la dimensiune completă
Pentru a determina posibilul transfer de miARN de la celulele stromale la celulele CLL prin vezicule extracelulare 13 sau prin comunicare intercelulară intercelulară (GJIC), 14 celule CLL și celule stromale au fost co-cultivate cu o membrană (pori de 0,4 μm, Transwell, Corning, Amsterdam, .) Sau în prezența inhibitorului GJIC 1-octanol (0,5 μM, Sigma, Diegem, Belgia). Am constatat că membrana a abolit creșterea nivelurilor miR-99a și miR-125b în celulele CLL, în timp ce inhibitorul GJIC nu a prezentat niciun efect (datele nu sunt prezentate). Aceste rezultate împiedică transferul acestor miARN de la celulele stromale la celulele CLL de vezicule extracelulare sau GJIC.
Pe scurt, observațiile prezentate subliniază faptul că, în condiții experimentale specifice, un număr foarte limitat de celule contaminante poate duce la rezultate artefacte în ceea ce privește cuantificarea miARN. Acest raport subliniază necesitatea unor controale adecvate în sistemele complexe de cooperare. În lumina acestui studiu, sortarea celulelor din populații mixte de celule cu puritate de până la 99,9% nu poate împiedica întotdeauna concluziile incorecte privind expresia miARN. Datorită sensibilității ridicate a metodelor actuale, preocupări similare se pot aplica analizei ARNm și proteine.
Informatii suplimentare
Fișiere PDF
Tabel suplimentar
Contribuțiile autorului
JP și EM au proiectat și realizat cercetarea, au analizat datele și au scris manuscrisul; GB a recrutat pacienți cu CLL și a editat manuscrisul.