obiecte

abstract

Trio Rho Guanine Nucleotide Exchange Factor (RhoGEF) Trio promovează polimerizarea actinei prin activarea directă a GTPase Rac1. Studii recente sugerează că fenotipurile comportamentale asociate cu tulburări ale spectrului autist (ASD) la modelele animale de ASD pot fi produse prin dereglarea controlului Rac1 al polimerizării actinei la sinapsele glutamatergice. La om, am găsit un grup mare de mutații legate de ASD de novo în domeniul activării Trio a Rac1, GEF1. Studiul nostru arată că aceste mutații produc fie forme hipofuncționale, fie hiperfuncționale de Trio în neuronii rozătoarelor in vitro. În concordanță cu creșterea sau scăderea patologică a neurotransmisiei glutamatergice observată la modelele animale de TSA, constatăm că aceste mutații duc fie la o reducere a expresiei sinaptice a receptorului AMPA, fie la o sinaptogeneză glutamatergică crescută. Împreună, descoperirile noastre sugerează atât activitatea Trio excesivă, cât și scăzută, precum și disfuncția sinaptică rezultată în patogeneza asociată cu ASD și indică calea Trio-Rac1 în sinapsele glutamatergice ca un posibil punct cheie de convergență a multor gene asociate ASD.

Am descoperit recent că proteina Trio Rho guanine nucleotide exchange factor (RhoGEF), împreună cu paralogul său Kalirin, este necesară pentru neurotransmisia glutamatergică 9. Expresia trio în creier este cea mai mare în dezvoltarea prenatală tardivă/postnatală timpurie, în timp ce expresia Kalirin nu atinge vârful până la adolescență 10, 11, 12. Izoformele Trio multiple derivate dintr-o singură genă sunt exprimate în creier 13. De exemplu, Trio-9 este izoforma predominantă exprimată în cortex și hipocamp. Atât trio-ul, cât și Kalirin sunt situate în compartimentul postsinaptic al sinapselor glutamatergice, denumite rotiri dendritice 10, 14. În rotiri, aceste două proteine ​​reglează funcția de sinapsă glutamatergică prin capacitatea domeniilor lor GEF1 de a promova polimerizarea actinei dependente de Rac1 9, 15, 16. În plus, am constatat că Trio și Kalirin sunt ținte ale fosforilării CaMKII, care sunt necesare pentru inducerea potențării pe termen lung (LTP) 9, un proces celular despre care se crede că este baza pentru învățare și memorie. Astfel, aceste proteine ​​joacă un rol crucial în reglarea sinapselor glutamatergice.

Aici, identificăm un grup mare de mutații legate de ASD de novo în domeniul activării Rac1 al Trio, GEF1. Gradul de aglomerare mutațională găsit în domeniul Trio GEF1 și efectul prezis de calcul al acestor mutații de novo asociate cu ASD asupra interacțiunilor Trio-Rac1 sugerează o asociere puternică a dereglării căii Trio-Rac1 în patologiile legate de ASD. Investigația sistematică a acestor mutații în Trio-9 relevă atât mutații hipomorfe cât și hipermorfe care afectează dramatic și bidirecțional funcția Trio și efectul lui Trio asupra neurotransmisiei glutamatergice în neuronii piramidali CA1 hipocampici. Modelele animale ale ASD arată o creștere și o scădere patologică a neurotransmisiei glutamatergice 17, 18, 19. Studiul nostru a dezvăluit mutații de tip ASD legate de misens într-o singură proteină sinaptică care activează Rac1, care poate produce modificări bidirecționale în neurotransmisia glutamatergică, implicând astfel atât o activitate Trio redusă, cât și excesivă și o disfuncție sinaptică rezultată în bolile legate de ASD.

Rezultatul

Mutații legate de ASD în Trio

hotspot

Mutații de novo legate de ASD în Trio. Mutații Missense, b prostii a c numărul copiei în Trio la persoanele cu tulburări legate de TSA. Sunt raportate diverse domenii proteice începând de la capătul N-terminal: domeniul Sec14, repetarea spectrului, domeniul GEF1 (compus din domeniul de omologie Dbl (DH1) și domeniul de omologie pleckstrin (PH1)), domeniul de omologie 3c Src (SH3) și domeniul GEF2 ( compus din domeniul de omologie Dbl (DH2) și domeniul de omologie Pleckstrin (PH2)). Pentru fiecare mutație, este furnizat diagnosticul unui individ, împreună cu informații despre schimbarea secvenței de aminoacizi Trio. Localizarea mutațiilor aminoacizilor din NP_009049.2

Imagine la dimensiune completă

Conform unei analize recente realizate de Exome Aggregation Consortium (ExAC), bazată pe 60.706 genomuri umane complet secvențiate, TRIO este una dintre primele 60 cele mai restrânse gene umane, sugerând o semnificație funcțională ridicată. Trio-ul are un număr excepțional de scăzut de mutații fără sens (z = 6, 29) și o pierdere a funcției (LoF) a mutațiilor fără sens (pLi = 1), în timp ce are o rată medie de mutații sinonime (z = 0, 19) 27 . Restricția din domeniul GEF1/DH1 este și mai pronunțată. În mod remarcabil, nu am detectat nicio mutație funcțională fără sens sau pierdere (LoF) în domeniul GEF1/DH1 în 9.937 genomi martor 24 (Tabelul 1 și Fig. 2a), indicând o îmbogățire puternică a mutațiilor legate de ASD în această regiune (Fig. 1). 2b). De asemenea, nu am găsit nicio mutație lipsă în domeniul GEF1/DH1 în baza de date 1000 Genomes 28 (Figura suplimentară 1a). Important, mutațiile sinonime enumerate în baza de date cu 1000 de genomi au fost prezente în această regiune (Figura suplimentară 1b). Luate împreună, aceste date indică o îmbogățire puternică a mutațiilor de novo legate de ASD în regiunea Trio GEF1/DH1.

Tabel în dimensiune completă

Un trio de mutații găsite în controlul și genomurile legate de ASD. Mutații Trio-9 găsite în genomii martor (de De Rubeis și colab., 2014 24). b Graficul arată numărul de mutații legate de ASD (bare roșii) și controale (bare negre) găsite în fiecare domeniu Trio-9 la persoanele cu tulburări legate de ASD și controale fără tulburări legate de ASD. Îmbogățirea în mutația Trio legată de ASD în fiecare domeniu Trio a fost calculată prin scăderea numărului de mutații martor din numărul de mutații legate de ASD de novo observate în fiecare domeniu. Triunghiurile transparente reprezintă prezența (roșu), absența (negru) și amploarea îmbogățirii ASD legate de mutație în fiecare domeniu.

Imagine la dimensiune completă

Pentru a evalua semnificația proteinelor Trio și a mutațiilor domeniului Trio-GEF1/DH1 în tulburările legate de ASD, am comparat numărul așteptat de mutații de novo cu mutațiile observate. Am folosit un model de mutație dezvoltat de Samocha și colab. 29. Rezultatele lui Samocha și colab. Acestea s-au bazat pe 1.078 de cazuri de TSA și 151 de cazuri de dizabilități mintale, iar acest studiu a reușit să identifice SCN2A și SYNGAP ca fiind semnificative în tulburările legate de TSA. În acest studiu, am observat un număr mult mai mare de cazuri (4890 în tulburările legate de ASD) și un număr mare de mutații lipsă în TRIO (11 cazuri de ASD comparativ cu 1,07 cazuri așteptate pentru același număr de indivizi din populația generală) . a îmbunătățit semnificativ statisticile, conducând la o asociere extrem de semnificativă a TRIO cu întregul sindrom cu sindroame asemănătoare ASD (valoarea P-8; Tabelul suplimentar 3). Am găsit o asociere și mai puternică cu sindroamele legate de ASD pentru subdomeniul RF1/DH1 care interacționează cu Rac1 (7 cazuri comparativ cu valoarea 0, 06, P așteptată de 13; Tabel suplimentar 3).

Se crede că mutațiile ASD din Trio modifică activarea Rac1

Efectele prezise ale mutațiilor DH1 legate de ASD asupra activării Rac1. Domeniul GEF1 în contextul întregii proteine ​​este prezentat mai sus cu domeniul GEF1 identificat printr-un pătrat roșu punctat. O prezentare generală a structurii complexului Trio-GEF1 și Rac1 este prezentată mai jos, cele două proteine ​​care interacționează sunt prezentate sub formă de caricaturi albastre și portocalii (cod proteic 2NZ8). Reziduurile de aminoacizi mutați în bolile legate de ASD sunt prezentate ca mărgele cu atomi de carbon magenta. Inserțiile amestecate reprezintă interacțiuni între resturile de aminoacizi din proteina de tip sălbatic și mutant. Reziduurile de tip sălbatic sunt etichetate și reprezentate într-o reprezentare a bățului, cu atomii de carbon colorate în violet. Aminoacizii mutați sunt prezentați cu atomi de carbon verzi sau galbeni. Legăturile de hidrogen/punțile de sare sunt prezentate în linii punctate. Moleculele de apă implicate în interacțiunile GEF1-Rac1 sunt indicate de margele roșii transparente

Imagine la dimensiune completă

Tabel în dimensiune completă

Expresia Trio-9 I1329HLAL * inhibă funcția sinaptică

Imagine la dimensiune completă

Scăderea cu 40% a amplitudinii AMPAR-eEPSC (Fig. 4h, j). Expresia Trio-9 I1329HLAL * nu a avut niciun efect asupra amplitudinii NMDAR-eEPSC (Fig. 4i, k). Acest fenotip a fost remarcabil de similar cu fenotipul observat cu Trio shRNA. Performanța pulsului de pereche (PPF) a fost, de asemenea, neschimbată de expresia postsinaptică a Trio-9 I1329HLAL *, indicând faptul că expresia acestui mutant nu a afectat eliberarea presinaptică de glutamat (Fig. 41).

Expresia Trio-9 K1431M inhibă funcția sinaptică

Am examinat apoi mutația Trio missense, Trio-9 K1431M. O persoană cu această mutație a prezentat simptome autiste severe și retard mental. Trebuie remarcat faptul că un studiu anterior care a folosit mutații pe scanarea alaninei pentru a identifica reziduurile importante din regiunea GEF1 Trio a identificat acest reziduu împreună cu R1428 ca fiind critic pentru activarea Rac1. Modelarea noastră a mutației K1431M a prezis întreruperea unui număr de interacțiuni mediate de hidrogen și apă, ducând la o afinitate redusă între domeniile Trio GEF1/DH1 și Rac1 (Fig. 3 și Tabelul 2). Analiza FLIM a arătat că Trio-9 K1431M, la fel ca Trio-9 I1329HLAL *, a redus semnificativ capacitatea Trio-9 de a activa biosenzorul Rac1 în celulele HEK293 (Fig. 5b). După cum s-a prezis, această mutație a fost puternic redusă prin activarea Rac1. Am exprimat apoi Trio-9 K1431M în neuroni piramidali CA1 și am constatat că Trio-9 K1431M fenocopical Trio-9 I1329HLAL *. Trio-9 K1431M cauzat

Scăderea cu 50% a amplitudinii AMPAR-eEPSC (Fig. 5c), care se datorează, de asemenea, probabil unei creșteri a sinapselor silențioase, deoarece a existat o scădere a conținutului cuantic fără o modificare a amplitudinii NMDAR-eEPSC sau o modificare a PPF (Fig. 5c). 5d-f). Similar cu Trio-9 de tip sălbatic, modificarea amplitudinilor NMDAR-eEPSC în neuronii care exprimă Trio-9 K1431M s-a datorat fluctuațiilor conținutului cuantic (Figura suplimentară 4c). Luate împreună, aceste date indică faptul că Trio-9 K1431M, la fel ca Trio-9 I1329HLAL *, este probabil să concureze cu Trio endogen, de tip sălbatic la sinapse și să conducă la o reducere a funcției sinaptice a AMPAR. În plus, am constatat că mutația missense din domeniul Trio GEF1, care a fost identificată la un individ fără ASD (Trio-9 S1575N) 28, nu a avut niciun efect asupra capacității Trio-9 de a crește amplitudinea AMPAR-eEPSC în piramida CA1 neuroni (Figura suplimentară 1a). a 5).

Imagine la dimensiune completă

Expresia Trio-9 P1461T inhibă funcția sinaptică

Imagine la dimensiune completă

Trio-9 D1368V are ca rezultat hiperfuncția Trio

Asocierea specifică a mutațiilor Trio cu ASD este susținută de analiza paralogului său apropiat, Kalirin, care are un profil unic de exprimare a dezvoltării. La Kalirin nu s-au observat mutații fără sens asociate cu TSA, deși au jucat un rol similar în reglarea sinapselor glutamatergice 9. Trio-ul este foarte exprimat în dezvoltarea postnatală timpurie și scade odată cu vârsta de 10 ani. În schimb, expresia Kalirin nu atinge vârful până la adolescență 11, 12. În special, funcția calirinei este implicată în tulburările neuropsihiatrice ulterioare, cum ar fi schizofrenia și boala Alzheimer 38, 39, 40, 41. O mutație în domeniul GEF1/DH1 al Kalirin care a inhibat activarea Rac1 a fost, de asemenea, găsită la un individ cu schizofrenie. Astfel, profilurile de expresie ale lui Trio și Kalirin par a fi în concordanță cu vârsta de debut a bolilor în care sunt implicați, sugerând că întreruperea mediată de Rac1 a reglării sinaptice în diferite momente de timp ale dezvoltării creierului duce la diferite boli legate de creier .,

S-a descoperit recent că întreruperea reglării sinaptice a actinei mediate de Rac1 stă la baza dezvoltării fenotipurilor comportamentale legate de ASD în modele animale bine stabilite de boli legate de ASD 5, 6, 7. Un studiu recent a identificat, de asemenea, Rac1 ca un punct probabil de convergență a mai multor gene cu risc ASD 8. Aici identificăm domeniul de activare Rac1 al proteinei de reglare a actinei sinaptice, Trio, ca un punct fierbinte pentru mutațiile de novo asociate cu ASD. Deoarece dereglarea neurotransmisiei glutamatergice se crede că stă la baza fenotipurilor comportamentale în multe modele animale de ASD și pentru că proteinele din avalul activității Trio nu au găsit mutații substanțiale legate de ASD, este tentant să speculăm că funcția Trio modificată reprezintă un punct major de convergență a unui număr de factori care dau naștere TSA. În viitor, va fi necesar să se determine prevalența funcției Trio modificate la persoanele cu ASD și să se stabilească dacă terapiile legate de Trio pot fi aplicate pentru a inversa fenotipurile comportamentale legate de ASD la un număr apreciabil de indivizi cu această boală.

metode

Modelarea mutației

Efectul mutațiilor asupra stabilității și legării au fost prezise folosind structura cristalină de înaltă rezoluție a complexului Trio GEF1 cu Rac1 (codul PDB 2NZ8). Calculele au fost efectuate folosind software-ul de modelare moleculară ICM (Molsoft LLC). Optimizarea energetică a conformației proteinelor mutante a fost efectuată utilizând algoritmul Monte Carlo de probabilitate părtinitoare. Schimbarea energiei libere în stabilitatea proteinelor stability Stabilitatea G (1) și legarea proteinelor ind G legarea (2) a fost apoi calculată ca o diferență în plierea sau legarea energiilor libere ale proteinelor mutante și de tip sălbatic:

Mutațiile cu legare ∆∆G> 2 sau stabilitate ∆∆G> 2 au fost prezise ca fiind perturbatoare pentru activarea Trio a Rac1.

Constructe experimentale

Human Trio-9 (sau Trio-9s în ref. 13) a fost generat dintr-un ADNc Trio-FL furnizat cu generozitate de Dr. Betty A. Eipper (Universitatea din Connecticut). Mutațiile Trio legate de ASD au fost făcute din ADNc Trio-9 folosind PCR cu extensie suprapusă urmată de clonarea In-fusion (Clontech). Toate plasmidele au fost confirmate prin secvențierea ADN-ului. ADN-uri Trio-9 au fost donate într-un vector pCAGGs conținând IRES-mCherry. Un vector pFUGW care exprimă numai GFP a fost co-exprimat cu construcții pCAGG-IRES-mCherry pentru a îmbunătăți identificarea neuronilor transfectați și a fost folosit ca vector de control pentru imagistica coloanei vertebrale. Construcția biosenzorului Rac1 se afla într-o coloană vertebrală pTriEx-HisMyc, a fost descrisă anterior în ref. 30 și a fost generos furnizat de Dr. Jaap D. van Buul (Sanquin).

Transfecția celulară HEK293

Celulele HEK293T (ATCC) au fost cultivate în DMEM cu 10% FBS într-un incubator la 37 ° C furnizat cu 5% CO2. Celulele au fost placate pe plăci de fund de sticlă de 35 mm acoperite cu Matrigel. Celulele au fost crescute până la confluența de 50% înainte de a fi transfectate cu structurile de expresie Trio-9 împreună cu biosenzorul Rac1 utilizând reactivul de transfecție FuGENE HD. A fost utilizat un raport ADN biosenzor Trio-9/Rac1 de 1: 1. Celulele placate au fost incubate în amestecul de transfecție timp de 16 ore și apoi înlocuite cu mediu proaspăt. Au fost efectuate experimente HEK293

20 de ore după transfecție.

Imagistica pe toată durata fluorescenței (FLIM)

$$ E = 1 - \ tau DA> \ tau D $$

Fazorul biosenzorului FRET în absența activatorului a fost obținut dintr-un preparat independent. Fazorul corespunzător donatorului stins a fost calculat conform ecuației de stingere (3). Pozițiile tuturor fazorilor posibili care sunt stingeți cu diferite eficiențe descriu o traiectorie curbată în graficul fazorilor. Poziția experimentală a fazorului unui pixel dat de-a lungul traiectoriei a determinat cantitatea de stingere și, prin urmare, eficiența FRET. Contribuțiile fondului și ale donatorului fără acceptor sunt evaluate utilizând regula combinației liniare 49, 52, cu fazorul de fond și donatorul neîntrerupt determinat independent. Toate transformările fazorilor și analiza datelor FLIM au fost efectuate utilizând software-ul SimFCS (Universitatea din California, Irvine).

electrofiziologie

Analiza densității coloanei vertebrale

Pentru analiza densității coloanei vertebrale, controlul și neuronii piramidali experimentali CA1 în culturile organotipice de felie de hipocampal realizate din pui de șobolan P6 au fost transfectate biolistic cu FUGW-GFP și pCAGGS-IRES-mCherry construiesc aproximativ 18-20 h după placare. Imaginile au fost achiziționate la DIV 7 folosind microscopie cu rezoluție superioară (Elyra Microscope System, Zeiss). Pentru utilizare cu microscopul inversat disponibil și obiectivul obiectiv cu imersie în ulei, feliile au fost fixate în 4% PFA/4% zaharoză în PBS și spălate de 3 ori cu PBS. Pentru a amplifica semnalul GFP, feliile au fost apoi blocate și permeabilizate în 3% BSA în PBS conținând 0,1% Triton-X și colorate cu anticorp primar împotriva GFP (2 μg/ml, Life Technologies A-11122) urmate de spălări în PBSTx și colorare cu Alexa 488-conjugat secundar (4 μg/ml, Life Technologies A-11034). Feliile au fost prelucrate ulterior cu un protocol 55 abreviate bazat pe SeeDB, în încercarea de a reduce aberația sferică. Feliile au fost apoi montate în SlowFade Gold (Life Technologies) pentru imagistică. Stivele Z au fost realizate din secțiuni de 30 um de dendrite apicale secundare

30 fromm de la soma. Imaginile au fost achiziționate cu un obiectiv de 100 × ulei (100 ×/1,46) în modul SIM folosind o rețea SIM de 42 μm furnizată și procesate și reconstruite folosind software-ul furnizat (Zen, Zeiss). Un experimentator, orbit de starea imaginii, a efectuat analiza imaginii pe secțiuni individuale folosind ImageJ pentru a număra coloanei vertebrale care se extind lateral din dendrita.

analize statistice

Pentru statisticile privind mutațiile legate de ASD în Trio, am folosit un test Poisson simplu, similar cu cel utilizat în Samocha și colab. 29. Numărul așteptat de mutații de novo în proteina Trio la 4890 de indivizi cu tulburări legate de ASD a fost calculat pe baza probabilității de mutație specifică genei, determinată de Samocha și colab. Numărul așteptat de mutații de novo în domeniul Trio-GEF1/DH1 a fost estimat prin redimensionarea numărului așteptat de mutații în Trio cu asumarea unei probabilități egale de mutație de-a lungul genei. A fost utilizat un prag de semnificație la nivelul genomului, valoarea P de -6. Pentru înregistrări electrofiziologice pereche de amplitudine eEPSC, a fost utilizat un test de rang semnat Wilcoxon pentru date pereche. Wilcoxon Rank Sum Tests au fost utilizate pentru a compara datele electrofiziologice în condiții independente. Măsurătorile de facilitare a pulsului asociate și datele privind densitatea coloanei vertebrale au fost analizate utilizând un test t al Studentului, asociat și respectiv, nepereche. Toate testele statistice efectuate au fost duble și cu toate testele o valoare P de