Abstract

Peptida natriuretică atrială (ANP) este o componentă importantă a sistemului peptidic natriuretic. Mastocitele joacă un rol major în multe sisteme de reglementare. Între timp, implicarea acestor celule în activitatea ANP este insuficient studiată. În această lucrare, am demonstrat prezența ANP în mastocite peritoneale de șobolan. Fracțiunea mastocitară pură a fost obținută prin separarea celulelor peritoneale de șobolan pe un gradient de densitate Percoll. Două proteine ​​imunoreactive ANP cu greutăți moleculare de 2,5 kDa și 16,9 kDa au fost detectate în lizate din aceste mastocite prin Western blot. Etichetarea imunogold microscopică electronică a relevat prezența materialului imunoreactiv ANP în depozitarea, secreția și eliberarea granulelor mastocitare. Descoperirile noastre sugerează că mastocitele peritoneale de șobolan conțin atât prohormon ANP, cât și ANP. Ambele peptide sunt localizate în granule de celule secretoare de mastocite și eliberate printr-un mecanism de degranulare. Se discută că multe funcții ale mastocitelor se pot datora producției de peptide natriuretice de către aceste celule.

Peptida natriuretică atrială (ANP) este un hormon cu proprietăți diuretice, natriuretice și vasodilatatoare. Această peptidă este produsă în principal de cardiomiocitele atriale 1. Secreția de ANP de către cardiomiocite este indicată de prezența unor vezicule secretoare specifice, așa-numitele granule atriale, în aceste celule. Conținutul granulelor atriale este eliberat din cauza supraîncărcării, lipsei de oxigen și a multor alte procese fiziologice și patologice din miocard. ANP este, de asemenea, produs de fibroblaste ovine care se infiltrează în infarctul miocardic 2, celulele 4 ale sistemului de conducere a șobolanului și bovinele 4, neuronii creierului șobolanului 5, celulele timusului șobolanului 6, celulele corneene bovine 7, celulele musculare netede ale șobolanului 8 și macrofagele șoarecilor 9. .

MATERIALE ȘI METODE

Izolarea mastocitelor

Fracțiunea mastocitară pură a fost izolată din suspensia de celule peritoneale de șobolan prin separarea celulelor pe un gradient de densitate Percoll așa cum este descris în protocolul detaliat 14. Au fost folosiți șase șobolani adulți Wistar cu greutatea de 250-300 g. După anestezie eterică și decapitare, 10 ml de PBS au fost injectați în cavitatea peritoneală a animalului; în timpul unui masaj abdominal ușor, cavitatea peritoneală a fost deschisă și spălarea celulei a fost colectată folosind o pipetă Pasteur. Spălările de la 6 șobolani au fost centrifugate la 120 x g timp de 10 minute, peleta a fost resuspendată în 0,5 ml PBS și suspensia celulară rezultată a fost stratificată pe un gradient Percoll de 88%. Gradientul Percoll a fost obținut prin adăugarea a 0,7 ml de RPMI concentrat de 10 ori (Gibco BRL) la 200 mM Hepes/NaOH 1M, pH 7,0 și centrifugare la 17.000 x g timp de 20 de minute. Gradientul preformat Percoll cu suspensia celulară stratificată deasupra a fost centrifugat la 450 x g timp de 15 minute. Fracțiunea mastocitară care acum ocupa fundul tubului a fost colectată și spălată de două ori în PBS. Probele de microscopie electronică ale suspensiei celulare au fost prelevate înainte (proba 1) și după separare (proba 2) în Percoll. Celulele izolate au fost studiate prin analiza Western blot și microscopie electronică imunocitochimie.

Analiza Western blot

Mastocitele purificate au fost lizate într-o soluție tampon cu următoarea compoziție (mM): 10 x Tris-HCI, pH 7, 4, 150 NaCI, 0,5% Nonidet-P40, 0,2 aprotinină, 0,2 leupeptină, 1 Na- ortovanadat, sodiu 1 -fluorură. 0,2 fluorură de fenilmetilsulfonil și 20% glicerol. Proteinele lizat au fost separate prin electroforeză 15 în gel de poliacrilamidă SDS 20% și transferate într-o membrană nitrocelulozică 16. Detectarea proteinelor imunoreactive ANP a fost efectuată cu un anticorp policonal primar de șobolan de iepure sintetic C-terminal ANP (aminoacizi 99-126, Peninsula Lab. Inc., Bachem) diluat 1: 1000 și anticorp secundar de hrean conjugat cu peroxidaza de hrean pe IgG de șoarece (Sigma). Proteinele de pe imunobloti au fost detectate printr-o metodă de chemiluminescență crescută. Un șobolan comercial ANP (Sigma) a servit drept control. Pentru calibrare a fost utilizat un kit pentru greutăți moleculare de la 2,5 la 17 kDa (Sigma).

Imunocitochimie cu microscop electronic

Au fost utilizați următorii anticorpi: același anticorp primar ca pentru Western blot, diluat 1: 1000 și aur conjugat (10 nm) proteină A (Sigma) diluat 1:20 ca anticorp secundar.

Celulele au fost fixate cu 2,5% glutaraldehidă în tampon de cacodilat de sodiu 0,1 M, pH 7,4, timp de 1 oră, postfixate cu 1% Os04, colorate în bloc cu acetat de uranil, deshidratate și plasate în Epon-Araldit conform procedurii standard. Secțiunile ultra-subțiri au fost tăiate cu un cuțit de diamant și montate pe grile de nichel. Grile de feliere au fost tratate în H202 și apoi incubate peste noapte la 4 ° C cu anticorpul primar, urmată de incubare timp de 1 oră la temperatura camerei cu anticorpul secundar. Preparatele au fost colorate cu acetat de uranil și citrat de plumb și examinate la microscopul electronic JEM 7A la 80 kV. Specificitatea imunocolorării a fost evaluată cu următorul control: prin omiterea etapei antiserului primar și aplicarea anticorpului secundar singur. Controlul a dat rezultate negative, adică depozite aleatorii nesemnificative de particule de aur pe secțiuni. Proporția mastocitelor din probele 1 și 2 a fost calculată folosind un microscop cu lumină pe secțiuni de polen colorate cu albastru de metilen. Au fost analizate 300 de celule pentru fiecare probă.

REZULTATELE

cercetarea

Mastocitele (săgeți), printre alte celule, au locuit în cavitatea peritoneală a șobolanului (eșantion 1 înainte de fracționare în Percoll). Partea de semitină colorată cu albastru de metilen. Bară = 5 um.

Imagine la dimensiune completă

Mastocite după izolare în Percoll (proba 2). Secțiunea de semitină colorată cu albastru de metilen. Tija = 5 μm.

Imagine la dimensiune completă

Micrografie electronică a mastocitei în stare degranulare. În celulă, între granulele de stocare cu material omogen, granulele descărcate cu o matrice dezorganizată și granulele eliberate (r) sunt observate lângă suprafața celulei. N, nucleu. Tija = 1 μm.

Imagine la dimensiune completă

Analiza Western blot

Identificarea proteinelor imunoreactive ANP din lizatul mastocitar peritoneal (Fig. 4) arată prezența a două proteine ​​recunoscute de anticorp în partea C-terminală a ANP. Aceste proteine ​​au avut greutăți moleculare de aproximativ 2,5 kDa și 16,9 kDa. Poziția proteinei cu greutate mai mică a corespuns poziției ANP a șobolanului martor.

Western blot de mastocite peritoneale de șobolan (linia A) și peptida sintetică ANP de șobolan (linia B) a reacționat cu anticorpi ANP anti-șobolan C-terminali (99-126) după separarea SDS prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă. Două benzi - 2,5 kDa și 16,9 kDa indică prezența ANP matur și proANP.

Imagine la dimensiune completă

Imunocitochimie cu microscop electronic

Localizarea intracelulară a materialului imunoreactiv ANP a fost demonstrată la nivelul microscopului electronic prin marcarea imunogold. S-a constatat că imunomarcarea este limitată la granulele secretoare de mastocite atât din prima, cât și din a doua probă. Au fost indicate depozitarea (Fig. 5) și excreția (Fig. 6) a granulelor, precum și granulele situate aproape de suprafața mastocitelor (Fig. 7). Nu s-a arătat localizarea particulelor de imunogold deasupra citosolului sau a oricăror organite de mastocite, altele decât granulele. Granulele eozinofile au fost, de asemenea, slab imunoreactive în secțiunile ultra-subțiri ale celulelor din prima probă (Fig. 8). Partea centrală a granulelor eozinofile a fost ocupată de electroni cristalizi cu structuri dense. Marca a fost plasată în mod egal pe toate componentele granulelor. Nu a fost observat niciun răspuns în alte celule. Preparatele de control (fără tratament primar cu anticorpi) au prezentat un rezultat negativ.

Micrografie imunoelectronică care arată prezența materialului imunoreactiv ANP în granulele de stocare a mastocitelor. Aceleași particule de aur sunt marcate cu săgeți. Tija = 0,2 μm.

Imagine la dimensiune completă

Imunomarcare ANP-pozitivă în granule secretate de mastocite. Aceleași particule de aur sunt marcate cu săgeți. Tija = 0,2 μm.

Imagine la dimensiune completă

Etichetarea ANP în granulele mastocitare eliberate. Aceleași particule de aur sunt marcate cu săgeți. Tija = 0,2 μm.

Imagine la dimensiune completă

Granulele eozinofile sunt slab imunomarcate pentru ANP. Săgețile indică particulele de aur depuse pe granule. Tija = 0,5 μm.

Imagine la dimensiune completă

DISCUŢIE

După fracționarea într-un gradient Percoll, suspensia celulară a fost compusă din 98% mastocite. Puritatea acestei populații este o garanție că materialul imunoreactiv ANP detectat de Western blot provine din mastocite. ANP este cunoscut a fi un precursor cu greutate moleculară ridicată, o peptidă natriuretică proatrială (proANP) compusă din 126 de resturi de aminoacizi. Fragmentul C-terminal al acestei molecule reprezintă forma matură a ANP (99-126), care rezultă din clivajul prohormonului (vezi Studiul 17). Cu toate acestea, proANP neclivit este eliberat și în sânge și circulat cu ANP18 matur. Prezența proANP (1-126, 16, 9 kDa), dar nu a ANP matur (99-126, 2, 5 kDa) a fost arătată în extractele de țesut atrial de șobolan 3. Am constatat prezența a două proteine ​​imunoreactive ANP în mastocite peritoneale de șobolan. Una avea aceeași greutate moleculară ca ANP-2,5 kDa matură, în timp ce cealaltă proteină avea o greutate moleculară de 16,9 kDa, care corespunde greutății proANP de șobolan pe toată lungimea. Astfel, datele noastre sugerează că mastocitele peritoneale de șobolan conțin atât ANP matur, cât și precursorul acestuia.

Imunocitochimia la microscopul electronic a arătat că materialul imunoreactiv ANP este prezent în granulele mastocitare. Prezența materialului marcat în granulele de depozitare, excreție și eliberare indică faptul că secreția de ANP din mastocite are loc prin mecanismul clasic de degranulare.

Distribuția pe scară largă a mastocitelor în organism poate determina detectarea ANP în aproape toate țesuturile vertebratelor 19. Multe funcții biologice ale mastocitelor, cum ar fi potențialul imunoregulator 20, efectul antitumoral 21 și altele, se pot datora generării lor de ANP.

O particularitate importantă a mastocitelor este capacitatea lor de a produce emițătoare care au efecte opuse asupra aceluiași proces. De exemplu, mastocitele produc atât histamină, care are efecte pro-inflamatorii, cât și heparină, care are efect antiinflamator. Recent, s-a demonstrat că mastocitele inimii șobolanilor și celulele HMC-1 (linia mastocitelor umane) conțin renină, un activator al sistemului renină-angiotensină-aldosteron 22 și un antagonist natural al ANP 23, 24. Spre deosebire de ANP diuretic, renina exercită un efect antidiuretic. Se exprimă opinia că homeostazia cardiovasculară este menținută printr-un echilibru între sistemul peptidic natriuretic și sistemul renină-angiotensină-aldosteron 25. Astfel, secretând anumite cantități de renină și/sau ANP, mastocitele pot regla în mod eficient acest echilibru.

Mastocitele peritoneale joacă un rol important în procesele patologice abdominale. Prin urmare, îndeplinesc o funcție de protecție în patogeneza peritonitei septice 26. Sa demonstrat că chirurgia abdominală induce degranularea mastocitelor și crește factorii derivați de mastocite în lichidul peritoneal 27. Prezența ANP detectată în mastocite peritoneale poate, pe de o parte, explica multe funcții cunoscute ale acestor celule și, pe de altă parte, poate prezice unele dintre efectele lor biologice încă neexplorate, extinzând gama funcțională a mastocitelor. S-a constatat că mastocitele peritoneale de șobolan eliberează histamină (factor proinflamator) ca răspuns la efectul ANP 28, 29. Se poate presupune că în timpul inflamației intraperitoneale, acest proces are loc într-o manieră autocrină datorită eliberării de ANP din mastocitele activate. În mod interesant, ANP reduce, de asemenea, secreția mediatorilor inflamatori în macrofage și, prin urmare, are un potențial antiinflamator 30. Aceste date arată din nou dualismul funcțional al mastocitelor. Datorită efectelor sale biologice, ANP derivat din mastocite poate avea o mare importanță pentru reglarea stării fiziologice a organelor abdominale. De exemplu, se raportează că ANP afectează funcția ovariană la șoareci 31 .

Prezența materialului imunoreactiv ANP în granulele eozinofile, care a fost dezvăluită în lucrarea noastră, se poate datora producerii acestei peptide de către aceste eozinofile și/sau absorbției lor de ANP eliberată de alte celule, probabil mastocite. Această ultimă propunere este confirmată de datele care arată că eozinofilele sunt capabile să absoarbă produsele de granule mastocitare eliberate 32 .

Mulțumiri

Suntem foarte recunoscători Dr. Leonid Z PEVZNER pentru corectarea textului în limba engleză. Această lucrare este susținută parțial de Fundația Rusă pentru Cercetare de Bază (grant 05-04-49393).